纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取液、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶活性进行研究。结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6~10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

基于分光光度法构建纳豆激酶纤溶活性快速测定方法

为建立一种快捷、有效的纳豆激酶纤溶活性测定方法,在研究纤维蛋白平板法的基础上,构建了以透明圈面积为中间参数的纳豆激酶纤溶活力与吸光度值之间关系模型,通过测定纳豆激酶显色反应中的吸光度值,直接获得纳豆激酶的纤溶活性。结果显示改进后的酪蛋白方法可行,其模型方程为y=1877.77x-481.08(R2=0.9924)。验证结果显示模型相关性强,准确度较高,操作简便、快速、检测成本低,是一种高效的纳豆激酶纤溶活性快速检测方法。     

纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

纳豆激酶基因在酿酒酵母中的表达

目的:从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增纳豆激酶基因,以实现该基因在酿酒酵母中的表达.方法:通过PCR方法扩增纳豆激酶基因,利用DNA重组技术构建重组质粒pYES2-NK,转化酿酒酵母H158感受态细胞;经β-半乳糖诱导表达后,用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性.结果:克隆到大小为1192bp的纳豆激酶基因,编码397个氨基酸;活性检测表明酿酒酵母发酵液的上清液具有纤溶酶活性.结论:纳豆激酶基因在重组酿酒酵母中实现了分泌表达.     

保加利亚乳杆菌异源表达纳豆激酶的性质研究

目的:研究保加利亚乳杆菌中异源表达来自纳豆芽孢杆菌的纳豆激酶酶学性质及其体外溶栓作用。方法:从纳豆激酶的最适温度、热稳定性、最适pH值、pH值稳定性和金属离子及化学试剂等方面研究该酶的酶学性质,通过体外试验研究其溶血栓作用,并通过灭活纤溶酶原的方法分析其溶解纤维蛋白的作用方式。结果:保加利亚乳杆菌异源表达纳豆激酶的最适温度为40℃,在低于40℃时热稳定性较好,最适pH 7.0,pH值在6.0~8.0范围内较稳定。Ca~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)促进酶活的效果随浓度的变化而不同,其中Cu~(2+)、Hg~(2+)对该酶起明显的抑制作用,Ag+随浓度的增加抑制效果逐渐显著,而蛋白抑制剂PSMF对纳豆激酶具有明显的抑制作用,说明纳豆激酶为丝氨酸蛋白酶。体外试验表明:该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而非通过激活纤溶酶原,且该酶具有明显的体外溶栓作用。结论:为纳豆激酶的应用及开发新型功能性乳制品提供了理论基础。     

纤溶活性重组纳豆激酶在大肠杆菌中的表达

通过PCR方法扩增纳豆激酶成熟肽和纳豆激酶酶原(proNK)基因片段,并分别克隆到表达载体pET28a上,构建与His标签融合表达的重组表达质粒pET28a-NK和pET28a-proNK,转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和纤维蛋白平板检测目的蛋白的表达及表达产物的纤溶活性.结果表明,纳豆激酶成熟肽基因在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在,表达产物没有纤溶活性;纳豆激酶酶原基因在大肠杆菌中的表达产物能自我剪切,形成有纤溶活性的纳豆激酶,但同时对宿主细胞有降解毒性.     

枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶特性分析

分离鉴定溶栓酶高产菌株,对其所产溶栓酶的类型、相对分子质量及发酵曲线进行特性分析。从中国豆豉中分离一株纤溶酶高产菌株MX-6,经个体形态、菌落形态及16S r DNA基因同源性比对,确定该菌株为枯草芽孢杆菌。应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)克隆到1 473 bp的纤溶酶编码基因apr N,根据推测氨基酸序列与同源序列的多序列比对及系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-polyacrylamide gels electrophoresis,SDS-PAGE)确定枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的相对分子质量约28 ku,与预测的相对分子质量27 712. 72 u相吻合。枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的发酵曲线结果显示在72 h达到纳豆激酶最大合成量,在纤维蛋白平板上的溶圈直径高达21. 60 mm。为更好地实现纳豆激酶的开发及应用提供一定的理论依据和方法参考。     

免疫磁珠的制备及其在食品安全检测中的应用

目的 研究胃肠液对纳豆激酶纤溶活性的影响。方法 模拟人体胃液、肠液中的生理过程, 采用纤维蛋白平板法, 对粗酶液和含豆固体粉碎样品2种形态的纳豆激酶进行纤溶活性研究。结果 粗酶液和含豆固体粉碎样品在人工胃液处理5 h左右时, 活性分别下降到对照组的28%和35%, 说明2种状态的酶在酸性的胃液中都不稳定, 大部分活性丧失; 粗酶液和含豆固体粉碎样品在人工胃液处理4 h后, 再用人工肠液处理 5 h, 活性分别下降到对照组的89%和91%; 说明在人工肠液中2种状态的酶都较稳定, 都保持较高的酶活性。结论 为避免胃酸的破坏作用, 建议将纳豆激酶制成肠溶性的产品服用。     

来源于豆豉的枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的稳定性研究

以中国豆豉中筛选到的1株纤溶酶高产菌株———枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,应用聚合酶链式反应(PCR)成功扩增到1473bp的纤溶酶编码基因aprN,系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。研究了纳豆激酶对热、pH、金属离子、化学物质、抑制剂和变性剂的稳定性及传代稳定性。结果表明:纳豆激酶在-20,4,30～50℃的热稳定性较好,pH在3～11之间酶活性相对稳定,Mg~(2+)、Ca~(2+)对纳豆激酶具有显著的激活作用,K~+、Fe~(2+)对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Al ~(3+)、Ba~(2+)有显著的抑制作用,Hg~(2+)导致纳豆激酶完全失活,牛血清蛋白、明胶、蛋白胨能够显著提高纳豆激酶的稳定性,丙二醇、海藻酸钠对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而乙醇显著降低纳豆激酶的稳定性。PMSF导致纳豆激酶的活性完全丧失,EDAT和DTT对纳豆激酶的活性基本无影响,10mmol/L的SDS显著降低纳豆激酶的稳定性,说明此纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,不是金属酶,不含二硫键,且具有良好的传代稳定性。结果显示该酶的稳定性较好,具有开发为溶栓药物的应用价值,有利于纳豆激酶的工业化应用。     

金属离子对纳豆激酶的化学修饰研究

纳豆激酶(Nattokinase,简称NK)是一种新型食源性纤溶酶,具有很强的溶血栓作用。本项研究采用金属离子对纳豆激酶进行置换修饰研究,找出最佳金属离子的种类和浓度,提高酶活性,以更大的发挥其药理学功能。实验结果表明,修饰后纳豆激酶的酶活性及稳定性有明显的提高,6mmol/L的Mg2+对酶有明显的激活作用,比天然酶提高了45%的活性。Ca2+、Mn2+、Ni2+则表现出不同程度的抑制作用。因此,可通过加入Mg2+来改善提高纳豆激酶的活性。     

通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。     

层析法分离纳豆激酶的研究

选高产酶的纳豆杆菌发酵,发酵液离心除菌后加入饱和度为30%硫酸铵去杂,然后加入65%的硫酸铵析出纳豆激酶粗提物,然后将粗提物分别过阴阳离子交换柱和疏水层析柱进行提纯酶。比较其提纯倍数和回收率,得出较好得分离纯化方案为:样品依次经过DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、CM-SepharoseFastFlow阳离子层析和Penpyl-SepharoseCl-4B疏水层析柱,纳豆激酶最终纯化倍数达到32.2,回收率为13.2%。     

纳豆激酶溶栓活性的测定方法

简介人体纤维蛋白溶解系统的生理学背景,对以此为依据建立的纳豆激酶溶栓活性测定方法进行了概括总结。     

纳豆菌分离、鉴定及纳豆激酶高产菌株的正向选育

从日本纳豆食品中分离到1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)Bs01-1菌株,根据纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶与蛋白酶活性的正相关关系,采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种的,成功地筛选到2株突变株MBS04-6和MBS04-9,其溶纤活性分别比出发菌株提高了87%和69%,达到4 179 IU/mL和3788 IU/mL。该法筛选菌株的正向突变率达到10%。     

纳豆激酶高产菌的快速筛选及其发酵纳豆特性

通过纤溶活性筛选法和纳豆激酶基因筛选法,快速、准确筛选到一株纳豆激酶高产菌株MJ-1,经16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。以黄豆为原料进行固体发酵制备纳豆食品,考察了纳豆食品的纳豆激酶活力、抗凝活性和抗氧化活性。在初始含水量60%、发酵温度37 ℃的条件下,纳豆激酶发酵活力在20 h达到最大值（90.18 FU/g,以干质量计）,达到了商业化纳豆的酶活力水平。抗凝活性分析显示该菌株可合成抗凝成分,赋予纳豆食品抗凝活性,在提取物质量浓度为3 mg/mL时,抗凝效率达91%。同时,与未发酵黄豆相比,发酵过程显著提高了其抗氧化活性。     

纳豆激酶的制备及其改性研究进展

纳豆激酶(EC 3.4.21.62)是纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶,在体外和体内均具有强烈的纤维蛋白溶解活性。提高纳豆激酶的产量及其稳定性和经口服后的生物利用度具有重要的研究意义,该文综述了野生菌、基因工程菌及动植物细胞发酵/培养制备纳豆激酶的方法,及其稳定性和生物利用度等性能改善方面的研究进展,并对纳豆激酶研究的发展前景进行了展望。     

纳豆激酶制剂的研究

以选取的纳豆菌-9号为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5L发酵罐扩大培养，确定最优发酵培养条件，纳豆激酶活力较摇瓶培养提高2．05倍；发酵液经真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉，并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。