降解纤维素复合菌系F-7产纤维素酶的分离纯化及性质研究

目的:对真菌复合菌系F-7所产纤维素酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。方法:通过(NH4)2SO4分级沉淀、透析、葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-75分离纯化技术,分离纯化来源于葡萄座腔菌属、米根霉、尖孢镰刀菌混合纤维素酶液中的内切葡萄糖苷酶。结果表明,CMC酶活在p H3.0~7.0的条件下,最适反应p H值为4.8,最适反应温度为50℃,超过60℃酶活迅速下降。结论:经凝胶层析柱Sephadex G-75和SDS-PAGE后第一个峰已纯化,得到了一种相对分子量约为66.2 ku的纤维素酶。分离纯化后该酶的比活力提高了1.75倍,回收率为20%。为进一步研究此纤维素酶的组分、结构和理化特性奠定了基础。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

海洋胶红酵母菌CD-008产超氧化物歧化酶发酵条件优化及酶分离纯化

在单因素试验基础上,结合Plackett-Burman、Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析以确定海洋胶红酵母菌Rhodotorula sp. CD-008产超氧化物歧化酶最佳发酵条件,并通过盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析研究了酶的分离纯化条件。结果表明,pH、转速、温度对酶活力有显著影响,最优发酵条件为pH 5.34、转速150 r/min、温度21.40 ℃,优化后发酵液酶活力达到6 430.52 U/g湿菌体,比优化前提高了1.53倍。粗酶液经65%饱和度的硫酸铵盐析、超滤离心、Sephadex G-100凝胶过滤层析后获得的SOD比酶活达到419.90 U/mg,纯化倍数为9.60倍,蛋白回收率为8.2%。SDS-PAGE凝胶电泳显示,纯化后的SOD的分子质量约为37.5 ku。     

啤酒麦芽中极限糊精酶的分离纯化

以发芽6 d的澳麦麦芽为原料,通过醋酸钠缓冲液萃取,硫酸铵分部盐析,Sephadex G-25凝胶过滤柱层析,DEAE Sepharose FF离子交换柱层析及Sephadex G-100凝胶柱层析,获得极限糊精酶,其比活力由3.40m U/mg提高到558.26 m U/mg,纯化倍数和回收率分别为164.2倍和16.5%。该酶经SDS-PAGE检测分子质量约为101.9 ku,IEF检测等电点p I约为4.66,并且电泳图谱均显示单一条带,说明该纯化酶达到电泳纯。     

源于木霉TP-24的β-1,3-葡聚糖酶提取纯化研究

为实现不溶性酵母β-1,3-葡聚糖的酶法改性增溶,对源于木霉TP-24的β-1,3-葡聚糖酶分离纯化进行研究.结果表明,用含有2?Cl2的pH5.0醋酸缓冲液浸提固态发酵曲180 min,所得粗酶液经2%活性炭脱色、(NH4)2SO4分段盐析、透析浓缩、Sephadex G-100层析分离,获得了高酶活的蛋白峰Ⅰ和杂蛋白峰Ⅱ.浓缩含酶组分进行SDS-PAGE电泳分析,酶蛋白呈单一谱带,分子量近似为54.56 ku,酶比活力为342.95 U/mg,相对于粗酶液纯化了28.67倍,酶的回收率为45.15%.     

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。     

黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析,得到5个洗脱峰,其中峰2含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰3含内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶,酶系较全面;峰5含内切酶和外切酶;峰1和峰4没有纤维素酶活性。采用DEAF FF弱阴离子交换柱层析对峰2进行分离纯化,从中分离纯化得到1种内切葡聚糖苷酶组分,经SDS-PAGE电泳分析,其分子量为61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC酶活在pH4.0～6.0的条件下,可保持初始酶活的70%～80%,最适酶反应pH值为5.0;温度在30～50℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为50℃,若超过60℃,酶活迅速下降。     

Isolation and Purification of Cellulase Produced by Mixed. Fermentation of AspergiUus niger Ⅲ and Trichoderca viride Ⅰ and Their Enzymatic Properties

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析,得到5个洗脱峰,其中峰2含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰3含内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶,酶系较全面;峰5含内切酶和外切酶;峰1和峰4没有纤维素酶活性。采用DEAF FF弱阴离子交换柱层析对峰2进行分离纯化,从中分离纯化得到1种内切葡聚糖苷酶组分,经SDS-PAGE电泳分析,其分子量为61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC酶活在pH4.0～6.0的条件下,可保持初始酶活的70%～80%,最适酶反应pH值为5.0;温度在30～50℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为50℃,若超过60℃,酶活迅速下降。     

青霉菌柚苷酶的分离纯化及酶学性质

对来源于Penicillium sp.1523的柚苷酶分离纯化工艺进行了系统分析,依次采用超滤、硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析操作对柚苷酶进行逐级纯化,通过SDS-PAGE电泳对各步骤的纯化结果进行分析鉴定,并考察了温度、pH及不同金属离子对酶活性的影响。结果显示纯化后的柚苷酶比活力达到4478.76U/mg,纯化倍数为11.99倍,活力回收率为38.10%。纯化后的柚苷酶经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定显示两条清晰的条带,说明该酶由两个亚基组成,其分子量分别为89ku和72ku;同时酶学性质研究发现最适温度为50℃,热稳定性不理想,最适pH为4.0,Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、EDTA、Cu2+对该酶酶活有促进作用,而Fe2+、SDS在低浓度时便对柚苷酶酶活表现出抑制作用。本研究为青霉菌柚苷酶的大规模生物转化及分子改性提供了实验基础。     

毛云芝菌漆酶的分离纯化和性质研究

将发酵液经真空抽滤后得粗酶液,以硫酸铵为盐析剂进行分级盐析沉淀、再经DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对漆酶进行分离纯化,用SDS-PAGE证明可获得纯的漆酶,纯化倍数为183.69倍,酶活回收率为24.77%。实验表明,该酶在30℃条件下具有较高的稳定性;在pH3.4～5.8范围内的相对酶活均在80%以上,漆酶稳定性较好,pH3.8的时候漆酶的稳定性最好。     

葡甘聚糖酶高产菌株Q1发酵条件优化及酶的分离纯化

该研究以海洋来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Q1为出发菌株,通过单因素实验对葡甘聚糖酶产生菌Q1发酵条件进行优化,并将菌株Q1发酵所得上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心和Sephadex G-100凝胶过滤层析,得到电泳纯的葡甘聚糖酶,并研究其部分酶学性质。结果表明,最佳发酵条件为魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏添加量为0.2%,蛋白胨添加量为0.4%、氯化钠添加量0.4%、培养温度26 ℃、转速160 r/min、接种量5%、初始pH 7.0、装液量100 mL/250 mL。在此条件下,葡甘聚糖酶酶活为241.61 U/mL。葡甘聚糖酶相对分子质量为41.3 ku;酶最适作用底物为葡甘聚糖。     

肌酐水解酶菌株S-09发酵条件优化及酶的分离纯化

该实验以海洋来源的微小杆菌（Exiguobacterium sp.）S-09为出发菌株,对其发酵培养基和产酶条件进行优化。并将粗酶液经硫酸铵盐析、透析、超滤离心和Sephadex G-100凝胶过滤层析进行分离纯化。结果表明,其最佳发酵培养基为0.5%的肌酐作为碳源、0.3%胰蛋白胨和0.2%玉米浆作为复合氮源,诱导物肌酸含量为0.3%;其最佳发酵条件为作用pH值7.5、温度25 ℃、装液量50 mL/250 mL、接种量3%。Fe2+和Mn2+能显著促进产酶。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳结果显示,纯化后的肌酐水解酶分子质量为24.3 ku。     

一株阿里地区产纤维素酶菌株的筛选与鉴定

从西藏阿里地区冈仁波齐山脉附近筛选得到了一株产纤维素酶的细菌G1,经形态观察与16S rDNA的序列分析鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。该菌株在30 ℃、pH 7的初始条件下培养76 h后产酶量达到最高,酶活力为0.3 U/mL。酶学性质研究表明,B. licheniformis G1所产纤维素酶的分子质量约为65 ku,其最适反应温度为55 ℃,在30～60 ℃范围内保持50%以上的活力;其最适反应pH为6.0,在pH 5.0～6.0范围内保持95%左右的酶活力;此外,Mn2+对其纤维素酶活力有明显的促进作用,而Cu2+、Mg2+、乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶活有较强的抑制作用。     

产低温脂肪酶菌株的筛选、纯化及其部分酶学性质研究

从大黑山(大连)和海水中筛出59株低温细菌,从中筛选出10株产低温脂肪酶的菌株,分别对其进行紫外诱变,筛出一株高酶活的低温脂肪酶菌株。通过形态学、生理生化和分子生物学鉴定,菌株CZWOO1属于芽孢杆菌属(BacillusCohn),与Bacillusthuringien-si(sNR 043403.1)进化关系近,且同源性达到100%,故将其命名为Bacillus thuringiensis CZWOO1。苏云金芽孢杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析获得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其分子量约40ku。对纯化后的低温脂肪酶进行二级结构预测,结果表明其二级结构成分:α-螺旋10.6%,β-折叠40.1%,β-转角18.8%,无规则卷曲30.5%。对该菌脂肪酶的酶学性质初步研究表明,酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30min仅残留30%酶活性,酶的适宜作用pH范围在7~9,最适pH值为8。     

白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白的分离纯化

利用单因素试验及响应面分析法将从白斑狗鱼鱼肉组织中获取的抗冻蛋白进行分离纯化。试验以鱼肉抗冻蛋白的热滞活性（THA）为响应值,对提取温度、pH值、提取时间、料液比4个因素进行优化。结果表明：白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白提取的最佳工艺条件为温度5.14 ℃、pH值8.40、提取时间为1.88 h,料液比1∶2（g∶mL）,此时热滞活性达到0.061 2 ℃。验证试验结果显示热滞活性（THA）为（0.059 4±0.001 3）℃,与理论预测值基本吻合。经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-50分子筛层析柱纯化后获得了电泳纯的抗冻蛋白,其相对分子质量约为7.6 ku,热滞活性大约为（0.052±0.001 5） ℃。     

一株嗜热菌木糖异构酶的纯化与性质研究

研究了1株嗜热菌(Anoxybacillus flavithermus)所产木糖异构酶的分离纯化以及酶学性质。结果表明,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤、纤维素DE-52弱阴离子交换柱和Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析得到的木糖异构酶,分子量约为181 ku,由4个相同分子量的亚基组成。酶反应的最适温度为80℃,最适为pH为7.0且最适pH范围宽泛,pH6.0~11.0酶反应活性能保持80%左右。该酶热稳定性及耐碱性能良好,70℃保温1 h后酶活仍能保持近80%左右;pH5.0~8.0保温1 h后酶活仍能保持近80%以上,甚至pH12.0保温1 h后酶活性仍能保持40%左右。Mn2+和Co2+对酶活性有明显促进作用,Zn2+、Cu2+以及Al3+对酶活性有一定程度的抑制。     

根霉胞内α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01的菌丝体破碎液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了54.8倍,总酶活回收率达到27.3%,在SDS-PAGE上显示相对分子质量为85.6 ku的单一条带,凝胶过滤表明该酶表观相对分子质量为302 ku。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为55℃,表观Km值为(0.242±0.027)mmol/L,表观kcat/Km值为4.089×105L/(mol.s);对蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用,水解速度依次为138.3μmol/(h.mg)、19.7μmol/(h.mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的显著激活,但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等离子的强烈抑制。该酶活性在pH4.0～8.2保持稳定,在50℃时保温90 min,残余酶活达到了48%。