转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

目的实现转基因鲑鱼AquAdvantage的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法针对转基因鲑鱼的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因鲑鱼实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因鲑鱼实时荧光PCR方法特异性强,在600 000~60拷贝范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=-3.2194x+40.805,R~2=0.997,检测限为60拷贝,检测重复性良好。结论建立的品系特异性实时荧光PCR方法可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定。     

16种转基因大豆品系的实时荧光PCR法筛查

采用实时荧光PCR法,对河北主要进口转基因大豆口岸秦皇岛港及京唐港的45批次转基因大豆进行了16种转基因大豆品系筛查。结果发现,在45批样品中均检测到GTS-40-3-2品系;30批样品检测到MON89788品系,占所检测样品66.7%;14批样品检测到A2704-12品系,占所检测样品31.1%;2批样品检测到MON87701品系,占所检测样品4.4%;1批样品检测到MON87701×MON89788品系,占所检测样品2.2%;其他品系在所有45批样品中均未检测到。通过对河北主要进口口岸转基因大豆品系方面摸底筛查,为我国转基因大豆品系进口管控提供了数据支持。     

多品系混杂转基因大豆样品中复合品系的检测

摘要：目的 确认一份多品系混杂转基因大豆样品中是否含有复合性状转基因大豆。方法 采用实时荧光定性PCR方法对实验室留存的一份转基因初筛阳性大豆样品进行品系筛查检测,后分别采用单粒多靶点筛查检测和清洗后单粒多靶点筛查检测方法进行复合性状品系的确认。结果 经鉴定,该大豆样品中混杂了5种转基因大豆品系,检出复合性状转基因大豆为MON87708×MON89788品系,该品系为中国未经批准进口的转基因大豆品系。结论 鉴于目前缺乏完整的检测技术体系和技术标准,这种多品系混杂样品中掺杂未批准复合性状品系的行为非常具有隐蔽性和欺骗性,国内的农业安全监管部门和海关检疫部门都应该对此高度重视。     

转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的 为实现转基因甜菜GTSB77的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法 针对GTSB77的3′端外源插入片段与甜菜基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果 建立的GTSB77检测方法特异性强,定量限(LOQ)为16拷贝,扩增效率为102%,重复性测试结果相对标准偏差(RSD)介于0.21%～1.66%之间。结论 建立的实时荧光PCR方法可应用于GTSB77的鉴定检测。     

实时浊度LAMP法检测豆制品中转基因成分

通过设计转基因大豆内源基因(Lectin)、外源基因NOS和2个转基因大豆品系(GTS 40-3-2,MON89788)特异性LAMP引物,建立快速检测转基因大豆以及鉴定转基因大豆品系的LAMP体系,并选取国内豆制品利用CTAB法进行DNA提取,并针对上述基因进行PCR和LAMP扩增的对比,建立起了检测大豆制品中转基因成分的定性的LAMP方法。结果表明:4个LAMP方法均有较好的特异性,除了NOS、GTS 40-3-2的检测限为0.1%外,其他LAMP方法的灵敏度为0.01%,均能满足实际检测要求;在实时浊度LAMP法检测大豆制品转基因成分的鉴定中,传统的CTAB法能成功提取大豆粗加工制品的DNA,且DNA纯度能够进行核酸扩增反应。利用转基因外引物进行的普通PCR结果与实时浊度LAMP结果是一致的,说明建立的转基因实时浊度LAMP检测方法有很好的准确性。     

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）和芯片式数字PCR（chip digital PCR,cdPCR）平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。ddPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0copies/μL和8.2copies/μL;cdPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443copies/μL和7.646copies/μL;ddPCR和cdPCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。     

转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性实时荧光(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测方法。方法利用Taq Man实时荧光PCR(real-time PCR)技术,根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段P-e FMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为15 pg,相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA,重复性试验显示,其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

公共引物介导的多重定量PCR技术在转基因大豆检测中的应用研究

目的 建立公共引物介导的多重定量PCR法检测我国农业农村部允许进口的6种转基因大豆(包括: MON87701、DP356043、CV-127、MON87769、MON87705、MON87708)的方法。方法 设计并筛选出针对本研究涉及的6种转基因大豆对特异性引物, 在每对特异性引物的5’端均加上一段公共引物, 形成特异性嵌合引物。以某种转基因大豆DNA为模板, 加入多引物体系以及荧光公共引物验证GeXP(gene expression platform)多重检测体系的特异性, 每种转基因大豆DNA模板浓度分别稀释为20、2、1、0.2、0.02 ng/μL, 运用GeXP多重PCR方法进行单一DNA模板灵敏度分析并优化各对特异性嵌合引物的工作浓度。结果 多重PCR检测体系扩增出特异性片段, GeXP检出的各转基因大豆片段长度MON87701、DP356043、CV-127、MON87769、MON87705和MON87708分别为140.75、184.42、274.93、308.47、467.98和517.67 bp, GeXP 多重检测体系检测敏感性可达到为1 ng/μL, 扩增产物测序结果进一步说明了引物扩增的特异性。结论 本研究建立的基于GeXP系统的多重PCR定量检测技术, 可以准确鉴别6种转基因大豆, 为转基因大豆及其他转基因产品提供了新型的检测方法。     

北极苹果结构特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的为实现转基因北极苹果(Arctic~(TM) apple)目的标识管理,建立特异性实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法针对转基因北极苹果特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因北极苹果实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因北极苹果实时荧光PCR特异性强,定量检测限为20拷贝,扩增效率为96%,检测重复性良好。结论建立的特异性实时荧光PCR法可应用于转基因北极苹果的鉴定。     

The construction of pMD18-HT-Soybean as a calibrator plasmid and nested PCR assay for herbicide-tolerant soybeans

A multiple-target plasmid designated as pMD18-HT-Soybean, comprising part of a junction region of genetically modified soybean events A2704-12, A5547-127, MON89788 and GTS-40-3-2, and the endogenous soybean-specific lectin gene were constructed. The limit of detection for quantification of these four event-specific genes using pMD18-HT-Soybean plasmid was 20 copies. Furthermore, a nested PCR detection method was developed for the above four genetically modified soybean events. LOD value of nested PCR detection was 0.005 %. The above results demonstrated that the plasmid pMD18-HT-Soybean DNA represents a valuable alternative to genomic DNA as a calibrator for the quantification of soybean event GTS-40-3-2, MON89788, A2704-12 and A5547-127 in food and feed products. And the validated results also indicated that the developed nested PCR method can be used for identification and quantification of four genetically modified soybean events and its derivates.     

复合PCR荧光检测方法检测转基因水稻品系

建立一种高通量的转基因复合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）荧光检测方法,该方法通过对转基因检测内源、外源及品系基因检测引物进行荧光标记,经复合PCR扩增和毛细管电泳荧光检测,实现特异性强、高通量检测。结果表明,复合PCR荧光检测方法检测4 种转基因水稻品系特异性好,并且灵敏度达到0.1%,可以在进出口检验检疫、食品安全监测等领域进行应用。     

Establishment and evaluation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified soybean MON89788

A novel real-time PCR-based analytical method was established for the event-specific quantification of a GM soybean event MON89788. The conversion factor (C(f)) which is required to calculate the GMO amount was experimentally determined. The quantitative method was evaluated by a single-laboratory analysis and a blind test in a multi-laboratory trial. The limit of quantitation for the method was estimated to be 0.1% or lower. The trueness and precision were evaluated as the bias and reproducibility of the relative standard deviation (RSD(R)), and the determined bias and RSD(R) values for the method were both less than 20%. These results suggest that the established method would be suitable for practical detection and quantification of MON89788.     

烘焙食品中转基因成分定性检测的FAPAS能力验证结果与分析

目的分析参加FAPAS烘焙食品中转基因成分定性检测能力验证的结果。方法根据FAPAS组织方提供的能力验证作业指导书、国家标准GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法(部分步骤改进)和行业标准SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份烘焙食品测试样品进行转基因成分定性检测。结果该样品检出pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2和MON863品系(基因),未检出Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MON810、MON88017、MON89034、MON89788、NK603和TC1507品系。结论本实验重点对核酸提取方法进行改进并严格质控,满足了烘焙食品这类加工样品转基因定性检测要求,获得能力验证结果为满意。     

Fapas大豆粉中转基因成分检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检验人员的检验水平,扩大实验室影响力,增强竞争力。方法根据Fapas组织方提供的能力验证作业指导书及GB/T19495.4-2004《转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》和SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份100%大豆粉测试样品进行转基因成分检测。结果该批次大豆粉样品pCaMV35S、tNOS、Roundup Ready(GTS-40-3-2)品系检出转基因成分, MON89788品系未检出转基因成分。结论本次能力验证结果为满意。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。