环丙沙星生物条形码检测技术的研究

该文对快速检测食品中环丙沙星残留的生物条形码检测技术进行研究。首先将环丙沙星多克隆抗体与条形码DNA 链共同修饰在纳米金颗粒上制备纳米金复合探针、环丙沙星单克隆抗体与磁性颗粒结合制备磁性探针,然后对其采用可见光光谱法、透射电镜法进行鉴定;其次将上述探针与环丙沙星标准品进行杂交反应,在磁场的作用下,去除未结合的纳米金复合探针,然后收集标记成功的纳米金复合探针释放出的DNA 链,采用微孔板银染的生物条形码技术进行检测,得到环丙沙星残留量。检测环丙沙星的最低检出限为2.13 ng/mL。该方法与常规免疫检测方法相比灵敏度增强,具有实用性,为未来检测小分子物质残留量提供了新思路,也为制备环丙沙星生物条形码检测试剂盒奠定了基础。     

氧氟沙星单克隆抗体的制备及生物条形码检测技术的研究

为了建立快速、高效的免疫检测方法，为小分子药物残留提供新方向。本实验首先采用碳二亚胺法合成氧氟沙星完全抗原，后用免疫原免疫小鼠，将特异性强的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过杂交瘤细胞的多次“筛选-亚克隆”过程，制备氧氟沙星单克隆抗体。其次制备纳米金复合探针、磁性纳米探针，然后建立基于荧光定量PCR的生物条形码检测方法，在最优条件下采用荧光定量PCR生物条形码检测方法来间接测定氧氟沙星残留量。氧氟沙星线性回归方程为y=14.4263Logx+0.09184，R2=0.96。浓度范围在0.1-128 ng/mL时，检出限为0.17 ng/mL。结果表明基于荧光定量PCR生物条形码免疫分析方法检测氧氟沙星的结果可靠，能够应用于实际样品的检测中。     

纳米金生物条形码技术检测坚果中的黄曲霉毒素B_1

利用金纳米颗粒、黄曲霉毒素B1(AFB1)多抗和互补纳米金探针链、条形码DNA链制备纳米金探针(NP),纯化后进行透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见光谱(UV-vis)和浓度鉴定。将其与黄曲霉毒素B1单抗修饰的磁性微球探针(MMP)通过抗原抗体作用连接,制备MMP-AFB1-NP三明治复合物结构,利用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测在高温低盐条件下解链的条形码DNA,通过考察反应结束后每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数值与相应起始模板拷贝数之间的线性相关程度,建立黄曲霉毒素B1的生物条形码检测方法,并对检测体系进行了方法学评价。结果表明,本实验所建立的方法具有快速灵敏、特异性高等特点,每个模板的循环数值与该模板的起始拷贝数的对数具明显的线性关系y=-2.9054x+54.581,r=0.9991,检测灵敏度远远超过酶联免疫吸附法(ELISA)可达10-8 ng/m L,批间批内差值匀小于5%,用建立的生物条形码检测方法(BCA)对结构类似物进行特异性交叉试验,特异性良好。本法可用于花生、腰果等坚果类食品中AFB1的痕量检测。     

基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157:H7检测

建立一种基于生物条形码探针和金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)对致病性大肠杆菌O157:H7检测的新方法。用生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)和AuNPs与目标物大肠杆菌O157:H7进行免疫反应,形成MNPs/目标物/AuNPs“三明治”式复合体。利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来,通过DNA探针杂交条形码DNA引起AuNPs颜色变化来确定大肠杆菌O157:H7的存在,这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析,该方法在纯样品和牛奶中最低检测限为102CFU/mL,检测范围为102～106CFU/mL。应用基于生物条形码探针和AuNPs对大肠杆菌O157:H7检测具有准确、快速、操作简单的优点,为食品安全监测提供了新的方法。     

基于磁性纳米颗粒伏马菌素B双探针竞争ELISA检测方法的建立

建立一种基于磁性纳米颗粒能同时检测样品中伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)、FB2和FB3总量的双探针竞争酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。采用通过活化酯法制备磁性纳米颗粒-FB1捕获探针,利用改良过碘酸钠法合成McAb-HRP探针,对检测步骤进行优化,确定最佳反应条件。所建立检测方法对FB1和FBs的检测范围分别为0.07～1.98 ng/mL和0.10～9.86 ng/mL。在玉米样品中加标回收率范围为86.2%～105.1%。所建立方法检测结果与液相色谱-串联质谱检测结果的相关系数(R²)为0.996 6。双探针竞争ELISA检测法检测速度快、准确性高、重复性好,为玉米中伏FBs的快速筛选提供了新方法。     

基于上转换荧光标记和磁分离技术的沙门氏菌DNA检测新方法

利用水热法制备NaYF4:Yb3+Er3+荧光纳米颗粒,表面氨基化修饰后与探针核酸单链共价偶联,形成荧光标记显示探针。再将氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒与捕获核酸单链进行共价偶联,制备磁分离捕获探针。基于DNA杂交互补反应,加入体系中的目标DNA链分别与两端互补的荧光显示探针和磁分离捕获探针形成三明治夹心结构,通过外加磁场收集分离。加入的目标DNA链浓度越大,体系荧光强度越大。结果表明,复合结构的荧光强度与目标DNA链浓度成正比,在0.01~10 pmol/L范围内呈现良好的线性关系,最低检测限达3 fmol/L。     

高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体进行偶联,一步法制备磁荧光抗体探针,以DON人工抗原（DON-BSA）为检测线建立磁荧光免疫层析试纸。同时用胶体金标记DON单克隆抗体,以DON-BSA为检测线建立胶体金免疫层析试纸;制备的磁荧光抗体探针具有很好的磁性、荧光特性及抗体反应性,基于该探针成功制备了DON磁荧光免疫层析试纸,该试纸回归方程为y=－0.562x＋0.921,R2=0.990,IC50为5.611 ng/mL,检出限为1.089 ng/mL;制备了DON胶体金免疫层析试纸,该试纸裸眼检测灵敏度为500 ng/mL;定量检测回归方程为y=－0.543x＋1.485,R2=0.991,IC50为65.16 ng/mL,检出限为11.94 ng/mL。DON磁荧光免疫层析试纸的灵敏度是胶体金免疫层析试纸的10.96 倍。本实验建立的磁荧光免疫层析试纸模式可以同时实现样品的富集及荧光信号检测,提高检测灵敏度,并成功用于DON的检测,为磁荧光纳米颗粒广泛应用于免疫层析领域提供参考。     

基于酪胺信号放大技术的新型ELISA法高灵敏检测达氟沙星

目的 建立一种结果可视的新型ELISA法高灵敏检测达氟沙星。方法 基于酪胺信号放大原理,设计一种高灵敏检测达氟沙星的新型ELISA法;通过灵敏度、特异性实验评估本方法的有效性;将本方法应用于鸡肉和猪肉加标样本的检测进行方法验证。结果 本方法裸眼检测灵敏度为0.4 ng/mL,相较于传统ELISA方法（10 ng/mL）的裸眼检测灵敏度提高了25倍;在缓冲液中与其他几种常用药物无明显交叉反应;对鸡肉和猪肉样本中加标的达氟沙星可有效检出。结论 本方法灵敏度高,特异性好,可用于实际样本中达氟沙星的现场裸眼定性检测。     

基于纳米探针检测食源性肠炎沙门氏菌技术初探

目的建立纳米探针快速、准确检测食源性肠炎沙门氏菌的方法。方法利用二氧化硅磁纳米材料与肠炎沙门氏菌抗体制备纳米探针,将制备后的探针与经过荧光染色的肠炎沙门氏菌结合,并通过荧光显微镜和流式细胞仪对探针捕获的细菌进行检测,并比较2种方法的优劣。结果本方法设计合成了肠炎沙门氏菌纳米探针,通过荧光显微镜可以观察到复合纳米探针结合的5′106 CFU/mL和5′107 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌,在放大400倍的显微镜视野中成倍递增,该探针结合流式细胞术可以检测到5′105 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌。结论纳米探针技术结合荧光显微镜、流式细胞术可以更加快速、准确、灵敏地用于食源性肠炎沙门氏菌的定性检测,并有望通过进一步实验实现食源性致病菌的定量检测。     

用于痕量己烯雌酚检测的DNA折纸表面增强拉曼散射信号探针的制备

目的 制备具有表面增强拉曼散射效应的DNA折纸信号探针,应用于己烯雌酚的检测。方法 M13mp18单链DNA,适配体DNA链、Cy5信号分子标记DNA链等短链引物经两次退火,合成菱形DNA折纸。修饰了巯基DNA的金纳米粒子（Gold nanoparticles, Au NPs）通过碱基互补配对,自组装在菱形DNA折纸特定位点,构建一种DNA折纸信号探针。通过琼脂糖凝胶电泳以及原子力显微镜分析DNA折纸信号探针合成效率的影响因素,对比不同波长激光下的DNA折纸信号探针增强效应,优化实验条件,对不同浓度的己烯雌酚进行检测。结果 DNA折纸信号探针具有显著的表面增强拉曼散射效应,在785 nm激光波长下,己烯雌酚的最低检出浓度为0.05 μg/L。结论 环境雌激素严重危害人体健康,发展实时、高灵敏、快速检测技术是对其进行有效监控的重要环节。本研究制备的DNA折纸信号探针可作为表面增强拉曼光谱的基底用于己烯雌酚的痕量检测,在食品安全领域具有良好的应用潜力。     

磁分离结合CdTe发光量子点标记黄曲霉毒素B1免疫检测新方法

将发光量子点标记技术与磁分离富集技术相结合,基于竞争免疫分析,成功构建了黄曲霉毒素B1(AFB1)免疫检测新方法。首先合成了巯基丙酸包覆的CdTe发光量子点,同时采用水热法合成了氨基化磁性纳米粒子,通过TEM成像、荧光光谱、XRD、红外光谱等分别对其进行了表征。随后以AFB1人工抗原功能化磁性纳米粒子作为捕获探针,以发光量子点标记免疫球蛋白G(二抗)作为信号探针,基于磁性纳米粒子表面AFB1人工抗原和样品中AFB1与AFB1单克隆抗体之间的竞争免疫结合,建立了AFB1新型检测方法。实验优化条件下,荧光强度与黄曲霉毒素B1质量浓度在0.1~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,检测限为0.03 ng/mL。实际样品中加标回收实验结果表明,新方法准确性良好。     

Preparation of anti‐danofloxacin antibody and development of an indirect competitive enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of danofloxacin residue in chicken liver

BACKGROUND: Danofloxacin is used widely as both a clinical medicine for humans and a veterinary drug in animal husbandry. In this study a polyclonal anti‐danofloxacin antibody was prepared for the first time and a simple and rapid indirect competitive enzyme‐linked immunosorbent assay (cELISA) method based on the antibody was developed to monitor danofloxacin residue in chicken liver. RESULTS: The prepared antibody showed high sensitivity, with an IC₅₀ value of 2.0 ng mL^?1 towards danofloxacin, and good specificity, with significant cross‐reactivity only towards pefloxacin (22%) and fleroxacin (21%) among commonly used (fluoro)quinolones evaluated in the study. The developed cELISA test kit had a detection limit of 0.8 ng mL^?1, and satisfactory results were obtained when it was applied to chicken liver spiked with various levels of danofloxacin. The cELISA test kit was also used to detect danofloxacin in chicken liver samples purchased from a local food market, and the results were confirmed by liquid chromatography/mass spectrometry. CONCLUSION: The anti‐danofloxacin antibody prepared in this study exhibits excellent quality, with high sensitivity and good specificity. The cELISA test kit based on the antibody has a very low detection limit and is suitable for use as an efficient screening method to detect danofloxacin residue in foods and food products. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

基于上转换纳米颗粒和金纳米颗粒的Cd2+免疫检测新方法

基于上转换纳米颗粒(UCNPs)和金纳米颗粒(AuNPs)间的荧光共振能量转移(FRET)和抗原抗体的识别作用构建了Cd~(2+)的免疫检测平台。制备水溶性UCNPs表面修饰Cd-抗原作为能量供体探针,同时在AuNPs表面修饰Cd-抗体作为能量受体探针。抗原-抗体的免疫结合使得UCNPs和AuNPs发生FRET过程,引起UCNPs荧光猝灭;当检测体系中存在Cd~(2+)时,Cd~(2+)与UCNPs-抗原竞争性地结合AuNPs-抗体,从而抑制了FRET过程,荧光信号值随着Cd~(2+)质量浓度的增加而增加。结果表明,该方法检测范围为0.01～10 ng/mL,检出限可达0.01 ng/mL。将该方法应用于自来水样品中Cd~(2+)的检测,当加标水平为0.1、1、10 ng/mL时,回收率为98%～109%,相对标准偏差为3.4%～4.1%。     

新型瘦肉精多残留胶体金检测卡的研制

本文研究建立一种检测新型瘦肉精多残留胶体金检测卡的方法,能对大量样品进行定量检测。应用胶体金免疫层析技术,采用柠檬酸钠还原法,标记新型瘦肉精多克隆抗体并喷于玻璃纤维上,新型瘦肉精偶联OVA抗原和羊抗鼠Ig G分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装切割成新型瘦肉精多残留胶体金检测卡。通过灵敏度、假阳性、假阴性试验测试,梯度浓度显色结果表明,该检测卡的灵敏度分别为克伦特罗3 ng/m L、莱克多巴胺5 ng/m L、沙丁胺醇3 ng/m L、西马特罗5 ng/m L、班布特罗5 ng/m L、妥布特罗5 ng/m L、特布他林8 ng/m L、氯丙那林5 ng/m L、马布特罗5 ng/m L、溴布特罗8 ng/m L,检测时间为3 min,检测滴加的最优尿液量为70~90μL,批内和批间重复性为100%,假阳性率和假阴性率均为0。联检技术能实现现场快速检测,提高检测速度和准确性、降低检测成本,可作为生产过程监管和大批量样本的筛选。     

基于无标记金纳米簇的新型荧光生物传感器在赭曲霉毒素A快速检测中的应用

基于快速合成无标记核酸适配体（aptamer,Apt）模板金纳米簇（gold nanocluster,AuNCs）,并以核酸Apt部分互补的单链DNA修饰的金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）结合,构建新型荧光复合纳米生物传感器。利用检测靶标与核酸Apt之间更强结合力,使已荧光猝灭的Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs复合纳米传感器发生荧光共振能量转移,最终体系荧光强度值恢复的特性,用于快速准确检测赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）。结果表明,OTA质量浓度在0.01～2.5 ng/mL之间,荧光强度对应峰值（FI）与OTA质量浓度（C）呈现良好的线性关系,回归方程分别为FI=689.84lgC（OTA）＋8 315.31;检出限为0.025 ng/mL（信噪比为3）。该荧光生物传感器具有合成及操作简单、灵敏度高、选择性强、稳定性好及检测下限低的特点,预期在食品中相关有害因子的安全检测等提供一种新的思路和平台。     

磁控双色上转换荧光适配体传感器同时检测玉米和燕麦粉中的赭曲霉毒素A与玉米赤霉烯酮

目的 建立磁控双色上转换荧光法同时检测玉米和燕麦粉中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)与玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的含量。方法 利用溶剂热法合成了两种油酸封端的核壳型上转换纳米材料,通过表面改性法和戊二醛法制备了表面分别偶联OTA、ZEN适配体的核壳型上转换荧光探针。同时制备了表面原位生长四氧化三铁纳米颗粒的二硫化钼纳米片,作为淬灭剂。OTA、ZEN和适配体特异性结合后,通过磁分离后检测溶液的荧光强度值,从而实现OTA和ZEN的检测。结果 在最佳检测条件下,OTA与ZEN的质量浓度在0.05～500.00 ng/mL范围内与两种上转换荧光探针的荧光强度的对数值呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9949和0.9972,对OTA的检出限为3.97×10^-2ng/mL,对ZEN的检出限为3.11×10^-2ng/mL,应用于玉米粉和燕麦粉中OTA和ZEN的检测,加标回收率为91.7%～109.4%。结论 该方法检测灵敏度较高,并具有较好的特异性,可用于玉米和燕麦粉中OTA和ZEN的高灵敏检测。     

基于金纳米颗粒信号放大ELISA检测食品中恩诺沙星

以金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）为信号放大载体,利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的二抗为信号探针,建立一种基于AuNPs的信号放大酶联免疫检测方法（AuNPs signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay,AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA）,检测食品中恩诺沙星（enrofloxacin,ENR）。该方法对ENR的检测限（IC15）为5×10－4?ng/mL,半数抑制浓度（IC50）为0.24?ng/mL,检测范围为0.16～500?ng/mL,与建立的传统ELISA方法（IC50=8.76?ng/mL）相比,显著提高了检测灵敏度,并且该方法与环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星交叉反应率均小于0.1%,具有良好的特异性。该AuNPs-HRP-IgG?ic-ELISA方法的实用性得到了样品添加回收实验和商业化ELISA检测试剂盒的验证,其在牛奶样品中的加标回收率可达80.52%～102.66%,适用于实际牛奶样本中ENR的快速灵敏检测,也为建立其他食品危害物质的精准检测技术开发提供参考。     

基于免疫磁珠的胶体金免疫层析法快速检测水产品中地西泮残留

本研究针对水产品中地西泮残留的问题,建立了一种快速、灵敏的免疫磁珠-胶体金免疫层析法。采用链霉亲和素磁珠与生物素化地西泮单克隆抗体偶联制备的免疫磁珠,快速富集、分离水产品中地西泮残留,并结合胶体金免疫层析法进行半定量检测。结果表明,经过优化后试剂卡最佳工艺为金标抗体标记量25 μg/mL、T线抗原包被量0.6 mg/mL、C线羊抗鼠二抗包被量1.5 mg/mL、金标喷量3.0 μL/cm,地西泮加标浓度为1.0、5.0、10.0和15.0 μg/kg时回收率为78.34%~90.40%,相对标准偏差(RSD)为5.03%~8.96%。本方法特异性强、稳定性好,可在25 min内完成单个样本检测,对水产品中地西泮残留检出限为0.5 μg/kg,优于常规前处理法。经验证,对40份水产品样本检测结果与GC-MS法结果一致,证明免疫磁珠-胶体金免疫层析法可作为水产品中地西泮残留快速检测的有效手段。     

Ultrasensitive and simultaneous detection of 6 nonsteroidal anti-inflammatory drugs by colloidal gold strip sensor

In this work, an oxicam group–selective monoclonal antibody against 6 nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAID; meloxicam, lornoxicam, piroxicam, sudoxicam, droxicam, and tenoxicam) was prepared. Also, a spacer arm with carboxyl group was derived at the hydroxyl of meloxicam to generate the meloxicam hapten. The half-maximal inhibitory concentrations (IC₅₀) were, respectively, 0.31 ng/mL for meloxicam, 0.49 ng/mL for lornoxicam, 2.90 ng/mL for piroxicam, 1.95 ng/mL for sudoxicam, 3.08 ng/mL for droxicam, and 5.36 ng/mL for tenoxicam. A colloidal gold immunochromatographic strip based on the monoclonal antibody was developed for the detection of these 6 NSAID in milk. The results could be obtained by the naked eye in 10 min, and the cut-off values and the visual limits of detection in real samples were 5, 5, 10, 10, 25, and 25 ng/mL, and 0.25, 1, 0.5, 0.5, 1, and 1 ng/mL, respectively. This immunochromatopgraphic strip is a suitable tool for on-site detection and screening of oxicam NSAID in milk samples.