有机磷农药三唑磷单克隆抗体制备及鉴定

采用活泼酯法和混合酸酐法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,分别制备出一种免疫抗原(TZPM-A-BSA)和两种包被抗原(TZPM-A-OVA和TZPM-M-OVA)。通过免疫小鼠及细胞融合,并对杂交瘤细胞进行经多次筛选和亚克隆得到1株产三唑磷单克隆抗体阳性细胞株(FC3),其抗体亚类为IgM。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后的抗体经间接ELISA检测,该方法IC50=9.7μg/L,最低检测限(LOD)为1.0μg/L,定量检测线性范围(IC20～IC80)为2.5～100.0μg/L,与其他有机磷农药结构类似物无明显交叉反应,显示出高度的特异性。该抗体可进一步用于免疫分析试剂盒开发。     

储藏稻谷有害物质的确定及基于纳米抗体技术快检法的应用

以粮库中稻谷有害物质为研究对象,调查发现重金属残留以镉、有机磷农药残留以三唑磷和毒死蜱为代表的检出率较高。研究纳米抗体抗原制备,并应用于稻谷镉、三唑磷的快速检测中。结果表明,在纳米抗体试剂盒检测三唑磷的含量中,最高偏差小于10%。     

三唑类杀菌剂的免疫检测技术研究进展

三唑类杀菌剂是一类有机含氮杂环类化合物,兼具保护、治疗作用而被广泛应用于水果、蔬菜、烟草等农产品生产中。近年来,随着食品物流行业发展,三唑类杀菌剂在采后保鲜、贮藏和运输领域的应用也越来越普遍。但其半衰期长、不易降解,容易造成食品中残留超标问题,影响人类健康和进出口贸易。因此,实现三唑类杀菌剂的高效快速检测,对食品安全和产业健康发展具有重要意义。利用抗原-抗体结合的免疫检测技术具有高效、灵敏等优点,被广泛应用于食品中农药残留的快速检测。该文以三唑类杀菌剂的免疫检测方法为出发点,总结了当前国内外三唑类杀菌剂的半抗原的设计合成、完全抗原和抗体的制备进展,并分类介绍了已开发的三唑类杀菌剂的免疫检测方法(主要包括酶联免疫分析法、免疫层析试纸条、荧光免疫分析法和免疫亲和色谱法),为今后开发更为快速简便的三唑类杀菌剂的残留检测方法提供参考。     

吡虫啉残留酶联免疫吸附检测方法的建立

通过化学修饰合成吡虫啉(imidacloprid,IMI)人工半抗原,采用碳二亚胺法(EDC)将该抗原与牛血清蛋白和卵清蛋白偶联成功制备分子结合比合理的免疫抗原(IMI-BSA)和包被抗原(IMI-OVA)。对经IMI-BSA免疫的6周龄Balb/c实验鼠的免疫抗血清进行间接酶联免疫吸附和阻断酶联免疫吸附,初步探明抗吡虫啉多克隆抗体(IMI-pAb)的免疫学特性。在此基础上,采用聚乙二醇(PEG)介导细胞融合技术进行了免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,通过阳性杂交瘤细胞筛选和克隆化培养,获得3C8杂交瘤细胞株。结果显示:该3C8杂交瘤细胞株具有高效价、高亲和力和强特异性的特点;通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释倍数,建立基于吡虫啉单克隆抗体(IMI-mAb)的IMI残留阻断酶联免疫吸附,其线性范围为7.48×10-6～3.24×10-4mg/mL(R2=0.9928),最低检测限为8.00×10-6mg/mL。     

杀菌剂抑霉唑人工抗原的合成和鉴定

以咪唑乙醇为原料,与6- 溴己酸乙酯发生取代反应后再经水解反应合成抑霉唑半抗原(6-[1-(2,4- 二氯苯基)-2-(1- 咪唑基)乙氧基]己酸)。产物经薄层层析和1H-NMR 鉴定后,采用活化酯法分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联得到免疫原(HIA-BSA)和包被原(HIA-OVA),紫外光谱分析法计算得其偶联比分别为13:1 和7:1,初步说明人工抗原合成成功。通过免疫动物获得效价为1:64000 的抗体,采用间接竞争ELISA 法测定抗体的IC50 值为1.76μg/mL,从而进一步证明人工抗原合成成功,所得的抗体可用于ELISA 检测试剂盒的研制。     

双烯雌酚免疫抗原的合成与鉴定研究

本实验旨在合成和鉴定双烯雌酚(DEN)免疫抗原,通过双烯雌酚的酚羟基与琥珀酸酐反应,合成半抗原双烯雌酚-琥珀酰半酯(DEN-HS),采用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联制备免疫抗原(DEN-BSA)经紫外光谱分析和动物免疫试验证实免疫抗原合成成功,问接酶联免疫法分析证明其免疫鼠所获得的抗体与双烯雌酚有良好的特异性.实验成功合成了双烯雌酚免疫抗原,并获得了高效价的免疫血清,研究结果为免疫分析方法的进一步研究提供了试验基础.     

菜克多巴胺人工抗原的光谱表征及免疫鉴定研究

盐酸菜克多巴胺(Ractopamine hydrochloride,RCT)是一种β-肾上腺素受体激动剂,即使极低剂量残留对人类健康也有危害.为了建立简单、快速并适应现场检测的免疫分析方法,必须先合成它的人工抗原并进行鉴定.通过对莱克多巴胺进行结构修饰,用碳二亚胺将结构修饰了的莱克多巴胺与牛血清蛋白相偶联,经透析得到纯的莱克多巴胺人工抗原并冷冻干燥备用.结果表明,紫外光谱图中合成的人工抗原的特征吸收峰介于蛋白质和莱克多巴胺的特征吸收峰之间;人工抗原红外光谱图中呈现莱克多巴胺和牛血清蛋白的红外特征吸收峰;通过竞争ELISA实验表明用合成的人工抗原免疫的Balb/c小鼠血清中产生了莱克多巴胺的抗体,三种方法综合鉴定结果表明,莱克多巴胺人工抗原合成成功,该人工抗原可以进一步用于制备抗莱克多巴胺的单克隆抗体.     

有机磷农药三唑磷半抗原合成与鉴定

以三氯硫磷、苯唑醇、6-氨基己酸为原料,采用3步反应合成三唑磷半抗原6-[O-乙基-O-(1-苯基-1H-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酰胺基]己酸,经质谱和1H-NMR鉴定表明,合成成功,为进一步制备三唑磷抗体奠定了基础。     

葡聚糖抗体的制备及其Elisa检测方法的建立

制备并筛选葡聚糖拟糖蛋白抗原,通过动物免疫获得葡聚糖多克隆抗体并建立葡聚糖的Elisa检测方法,应用于实际样品检测。以还原胺化法制备大分子葡聚糖-牛血清蛋白(BSA)拟糖蛋白质,通过SDS-PAGE与自由氨基测定,优化葡聚糖拟糖蛋白抗原制备反应,建立直接竞争Elisa筛选抗原活性。以制得的葡聚糖T40-BSA拟糖蛋白抗原为免疫原,经过免疫白兔后获得高效价多抗;建立检测葡聚糖多抗的间接非竞争Elisa方法。确定拟糖蛋白抗原的最佳制备条件(n(葡聚糖)/n(氧化剂NaIO4)=1/120,偶联时间24 h);筛选获得不同制备条件下与标准抗体结合最强的抗原产物T40-BSA,动物免疫获得多抗,优化实验条件:以质量浓度10μg/mL的T40-BSA为包被抗原,37℃时血清多抗和酶标多抗的反应时间均为45 min,质量分数5%小牛血清为封闭液后洗板;建立了基于T40-BSA拟糖蛋白抗原的不同相对分子质量葡聚糖间接竞争Elisa检测方法,并应用于对市售白糖中葡聚糖T40的含量检测。研究结果表明,葡聚糖-BSA拟糖蛋白抗原制备条件不同,对其免疫活性有影响。建立的检测方法有良好的线性,能用于实际样品中葡聚糖含量的检测。     

动物性食品中氨苯砜dcELISA的检测

建立了动物性食品中氨苯砜残留快速检测技术。将氨苯砜重氮化后连接到牛血清蛋白(BSA)上制得免疫原BSA-DDS,免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,经Protein A-Sephros 4B对抗体进行纯化,在此基础上建立直接竞争ELISA方法。结果显示:该方法可制备目标抗原BSA-DDS和抗体,氨苯砜与载体蛋白偶联比可达到1∶10;建立的直接竞争ELISA方法的IC50为4.78 ng/m L,最低检测限达0.03 ng/m L,加标回收率为75.45%~91.75%。     

莱克多巴胺人工抗原及抗体的制备

莱克多巴胺是一种禁用β-兴奋剂,建立莱克多巴胺药残的快速检测方法是实现对其进行有力监控的有效途径,而莱克多巴胺抗体是快速免疫检测法的基本试剂。本实验用全新的方法研究了莱克多巴胺免疫原的合成,采用对氨基苯甲酸(ABA)和1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDE)将莱克多巴胺分别和cBSA、cOVA偶联,合成了莱克多巴胺的免疫原和包被抗原,并对其进行了紫外分析。用免疫原免疫新西兰大白兔,获得了高灵敏度和特异性的莱克多巴胺多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的IC50值为4.34ng/ml,所得多克隆抗体效价达到102400。     

酚酞单克隆抗体的制备

目的 建立免疫学快速检测减肥类保健食品中非法添加的酚酞, 制备酚酞单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺(carbodiimide, EDC)法合成免疫原和包被原, 用免疫原免疫Balb/C小鼠, 取小鼠脾脏与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合。采用竞争结合双阳性两步筛选法, 筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞, 利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞; 采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化, 利用酶联免疫吸附法鉴定纯化后的抗体。结果 成功合成了酚酞-BSA免疫原和酚酞-OVA包被原, 筛选获得酚酞杂交瘤细胞株FT/BSA/2019, 单克隆抗体的效价1×105。结论 本研究初步建立了特异性高的酚酞单克隆抗体的制备方法。     

1-芘丁酸人工抗原的制备及鉴定

为制备及鉴定1-芘丁酸（1-pyrenebutyric acid）人工抗原。采用碳化二亚胺（EDC）法将1-芘丁酸与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）进行偶联,合成人工免疫原PBA-BSA和人工检测抗原PBA-OVA;紫外扫描及SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示抗原制备成功;鼠源多抗血清的效价均已超过1 000,IC₅₀=14.31 ng/mL;与多环芳烃1-芘甲醇、1-芘甲醛、芘的交叉反应率小于14.40%,与菲、萘、苯并芘、BSA以及OVA交叉反应率均小于0.05%。作者成功制备出了PBA-BSA抗原,并且得到了敏感性良好的鼠源多抗血清,为后期单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立奠定基础。     

格列本脲人工抗原的合成与鉴定

目的：合成格列本脲人工抗原。方法：采用对氨基苯甲酸法制备半抗原,将半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过碳二亚胺法偶联制备免疫原(Gli-BSA)和包被原(Gli-OVA),利用紫外扫描进行抗原的化学鉴定,通过免疫原免疫Balb/c小鼠,间接酶联免疫吸附法测定抗血清进行生物鉴定。结果：制备了Gli-BSA、Gli-OVA的人工抗原,经紫外光谱扫描,偶联比分别为4:1和17.7:1。免疫小鼠后获得抗血清的效价均达到32000以上,半抑制质量浓度为10μg/mL。结论：成功合成了格列本脲人工抗原,并获得了格列本脲抗体,为格列本脲的免疫学检测方法进一步研究提供了实验基础。     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联 免疫吸附检测方法的建立

目的 制备地西泮(Diazepam DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法 利用EDC法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附,SPR等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果 成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(KDs)为4.0985×10_-7M,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC₅₀=10.8ng/mL,检测范围为0.45ng/mL-862ng/mL。结论 制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

氧氟沙星完全抗原的合成鉴定及其单克隆抗体的制备纯化

本试验通过碳二亚胺(EDC)法把氧氟沙星(OFLX)与载体蛋白BSA和OVA分别进行偶联制备免疫抗原和包被抗原,并采用紫外扫描法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对合成抗原进行了鉴定。通过杂交瘤常规技术获得了抗OFLX的单克隆抗体杂交瘤细胞株7株,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行了纯化。纯化腹水均属IgG1型。经过ELISA方法鉴定,纯化后的抗体效价>1:128000;交叉实验证明所得抗体与达氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、泰乐菌素均没有交叉反应,表现了良好的敏感性和特异性。     

氯吡脲人工抗原的合成与鉴定

为合成新的、有效的氯吡脲（forchlorfenuron,CPPU）人工抗原,在无水三氯化铝的催化作用下,采用傅克反应对CPPU小分子进行结构改造。采用碳二亚胺（carbodiimide,EDC）法将半抗原分别与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,获得CPPU的免疫抗原（CPPU-BSA)和包被抗原（CPPU-OVA）。采用质谱、元素分析和核磁共振氢谱对CPPU半抗原（CPPU-COOH）的分子结构式进行鉴定;采用紫外光谱和高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对偶联物的结构和相对分子质量进行鉴定。结果显示成功合成出CPPU人工抗原,为其抗体的制备和免疫学方法的构建提供了参考。     

酶联免疫吸附法检测动物源性食品中恩诺沙星残留量

为检测动物源性食品中恩诺沙星残留量,评估基于卵黄抗体的间接竞争酶联免疫吸附法检测恩诺沙星的可行性,用活性脂法将恩诺沙星同卵清蛋白偶联制备免疫原和包被抗原并用紫外光谱进行验证。用聚乙二醇-6000提取卵黄抗体。五免之后效价达到峰值1∶32 000。用间接竞争酶联免疫吸附法确定包被原质量浓度、卵黄抗体的稀释倍数和IC_(50)分别为38 ng/m L、1∶64 000和18.207 ng/m L,回归曲线方程为y=0.891 1-0.016 5x(R~2=0.990)。结果表明,制备的抗恩诺沙星卵黄抗体为进一步建立检测动物源性食品中恩诺沙星的残留的免疫方法提供参考依据。     

毒死蜱单克隆抗体制备及icELISA检测方法优化

目的制备毒死蜱单克隆抗体,建立icELISA(间接竞争酶联免疫吸附方法)检测方法并对其进行优化。方法以毒死蜱为基础物质,制备半抗原CPF-H1和CPF-H2,偶联蛋白制备人工抗原,进而通过免疫、细胞融合、筛选得到特异性的单克隆抗体,建立毒死蜱的icELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。结果质谱鉴定结果表明毒死蜱半抗原制备成功;半抗原偶联蛋白,紫外全波长扫描鉴定人工抗原制备成功;免疫动物、细胞融合并制备单克隆抗体;建立了icELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:PBST为标准品稀释液,包被抗原最佳稀释倍数为1:1000,抗体最佳稀释倍数为1:1000,一抗反应最佳时间为40 min,二抗反应最佳时间为30 min,制得毒死蜱标准曲线,毒死蜱对抗体的IC_(50)为73-25 ng/mL,线性范围IC_(20)~IC_(80)为32.52~260ng/mL,LOD为19.34 ng/mL。结论本研究为毒死蜱快速检测技术奠定了理论基础,对保障人们的身体健康具有重要的意义。