虾肽对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的:从红虾副产物中提取虾肽,研究其促MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及矿化的活性。方法:用MTT法检测不同浓度虾肽对MC3T3-E1成骨细胞存活率的影响;诱导成骨细胞分化,在3 d和7 d时,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性,在7 d和14 d时,测定其细胞骨钙素(OCN)及Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)含量,21 d时茜素红染色测定细胞诱导培养矿化程度;采用qPCR和Western blot方法检测虾肽对OPG/RANKL/RANK信号通路中骨形成关键基因和蛋白OPG、RANKL以及RUNX2表达的影响。结果:虾肽质量浓度为0.02,0.05,0.1 mg/mL时,显著促进MC3T3-E1细胞的增殖;ALP、OCN及COL-Ⅰ的含量相较于对照组均增加,矿化结节面积显著增大(P <0.05);此外,虾肽上调了ALP、OCN、COL-Ⅰ基因的表达,促进OPG和RUNX2基因及蛋白表达的水平,抑制RANKL基因及蛋白表达的水平。结论:虾肽能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化与矿化,激活OPG/RANKL/RANK信号通路,从而促进成骨细胞的分化及骨形成。     

鸡蛋黄蛋白质水解产物制备及其对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

鸡蛋黄经脱脂得到蛋黄蛋白质,直接以MC3T3-E1细胞增殖活力为指标,对水解条件进行优化,从而制备蛋黄蛋白质水解产物(egg yolk proteins hydrolysate,EYPH)并对其促MC3T3-E1细胞增殖分化的活性进行研究。结果表明:在对比胰蛋白酶与风味蛋白酶水解过程中,发现单一胰蛋白酶反应得到产物活性最好,胰蛋白酶反应的最佳水解条件为水解时间6 h、水解温度37℃、酶与底物质量比1∶50、p H 8.0。EYPH使MC3T3-E1细胞增殖活力得到提高,为129.89%,细胞周期分析得到S期细胞增加了4.69%,这2个方面证实EYPH对MC3T3-E1细胞的增殖活力有显著的提高。EYPH对MC3T3-E1细胞分化矿化有显著影响,碱性磷酸酶活力提高了9.1%;刺激骨钙素分泌,其含量上升2 mg/mL;形成更多的矿化结节。此外,EYPH还能刺激RUNX2特异性转录因子的基因表达,表达量提高了6.12倍。结果说明EYPH对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化有显著的促进作用,因此,EYPH对于抗骨质疏松方面有较好的应用潜力,为开发其功能性食品提供一定的数据参考。     

酶解牛骨肽促进骨骼生长功效的研究

采用低钙鼠粮饲喂Wistar大鼠,造大鼠低钙模型,口服给予模型组大鼠酶解牛骨肽3个月,研究酶解牛骨肽对低钙大鼠促进骨骼生长的作用,测定各实验组大鼠体重指数以及大鼠股骨重量、股骨强度、骨钙含量及血清钙离子含量等多项生理生化指标,同时做体外细胞实验,研究酶解牛骨肽对成骨细胞MC3T3-E1增殖情况的影响。结果表明:酶解牛骨肽对低钙大鼠骨钙含量水平的升高有明显作用(P 0.05),酶解牛骨肽可以在体外促进成骨细胞MC3T3-E1的增长,说明酶解牛骨肽在一定程度上能够促进骨骼生长发育。     

鲫鱼卵唾液酸糖肽对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化及OPG/RANKL基因表达的影响

目的:研究鲫鱼卵唾液酸糖肽(Ca-SGPP)对成骨细胞MC3T3-E1骨形成活性及OPG/RANKL基因表达水平的影响。方法:在MC3T3-E1细胞中加入不同浓度的Ca-SGPP,采用MTT法、试剂盒和茜素红染色法检测Ca-SGPP对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响;利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测MC3T3-E1细胞骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨保护素(OPG)及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因m RNA表达水平。结果:Ca-SGPP可显著促进MC3T3-E1细胞增殖及ALP、OCN和COL I的分泌,提高MC3T3-E1细胞矿化能力,上调其BMP-2表达水平及OPG/RANKL的比值,且分子质量大的糖肽效果更佳。结论 :CaSGPP具有促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的能力,其机制可能与OPG/RANKL比值上调有关。     

鱿鱼皮胶原蛋白水解肽对镉抑制MC3T3-E1增殖、分化及钙化的影响

目的:探究秘鲁鱿鱼皮胶原蛋白水解肽增强MC3T3-E1细胞抗骨质疏松的作用。方法:将培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组、氯化镉损伤组和胶原蛋白水解肽干预组;利用MTT法确定氯化镉的半数抑制浓度,建立细胞损伤模型;根据各组细胞增殖率差异,确定最佳胶原蛋白水解肽的添加量;通过细胞周期、凋亡,碱性磷酸酶活性的测定及Alizarin red染色法分析胶原蛋白水解肽在细胞增殖、分化、钙化阶段拮抗氯化镉的抑制作用。结果:与氯化镉损伤组相比,胶原蛋白水解肽干预组细胞活性升高(P0.01);处于G1期的细胞数量减小(P0.05),S期细胞数量增大(P0.05);凋亡率降低(P0.05);9,12,15 d时AKP活性升高(P0.05,P0.01,P0.01)。结论 :摄入一定剂量的氯化镉会抑制MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和钙化。胶原蛋白水解肽在一定程度上可改善此类损伤对MC3T3-E1细胞的影响。     

珍珠贝外套膜胶原蛋白肽及其锌螯合物的体外抑制骨质疏松作用

研究珍珠贝外套膜胶原蛋白肽（pearl oyster mantle collagen peptide,POM-CP）及其锌螯合物（zincchelating pearl oyster mantle collagen peptide,POMCP-Zn）对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。结果表 明：噻唑蓝检测结果显示,与空白对照组相比,POMCP-Zn能够显著促进成骨细胞的增殖,而POM-CP对成骨细胞 的增殖性无显著影响;与空白对照组相比,400 μg/mL的POM-CP和10 μg/mL的POMCP-Zn将成骨细胞的碱性磷酸酶 活性分别提高到1.31 倍和1.48 倍;POMCP-Zn还可以提高成骨细胞分化阶段Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素蛋白的分泌量, 同时促进成骨细胞矿化阶段骨结节的形成。综上所述,与POM-CP相比,POMCP-Zn对成骨细胞MC3T3-E1的增殖 和分化有较强的促进作用,POMCP-Zn有望成为预防骨质疏松症的潜在功能性食品。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白化学结构分析及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的：成熟的鲫鱼卵经提取、分离纯化得到唾液酸糖蛋白（sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs,CA-SGP）,分析其化学结构,及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。方法：采用水提法从成熟鲫鱼卵中提取水溶性蛋白,经阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离纯化鲫鱼卵水溶性蛋白得到CA-SGP,测定其基本组成,采用高效凝胶液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子质量和纯度,PMP柱前衍生高效液相色谱法测定其单糖组成;采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ,COLⅠ）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的分泌量及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性,茜素红染色法测定矿化结节的数量。结果：得到单一的组分CA-SGP,在高效凝胶过滤色谱色谱图上呈现单一的糖和蛋白的检测重叠峰,在凝胶电泳图上呈现单一弥散性条带,其蛋白质含量为14.33%,己糖含量为62.81%,N-乙酰神经氨酸（N-acetylneurainic acid,Neu5Ac）含量为19.72%。单糖组成测定结果显示：CA-SGP主要由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺组成,其物质的量比为7.61∶6.70∶1.00;MC3T3-E1细胞与CA-SGP共同孵育后,其增殖率显著增加,COLⅠ和OCN的分泌量分别增加了39.28%和83.06%,ALP活性提高了285.08%,矿化结节的数量增加了96.41%,说明CA-SGP显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。结论：CA-SGP为富含Neu5Ac的糖蛋白,具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的作用,对开发抗骨质疏松功能性食品具有重要意义。     

罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的:研究罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物(tilapia fish scale collagen hydrolysate,FH)对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的增殖和分化的影响。方法:采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,用p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)法测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,Elisa酶联免疫法检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)和骨钙素(Osteocalcin,OCN)的分泌量,茜素红染色法测定细胞外基质矿化结节的数量。结果:与空白对照组相比,FH对细胞的增殖性没有显著的促进作用,但是可以显著提高细胞ALP活性,促进Col Ⅰ和OCN的分泌。此外,FH可以促进细胞矿化结节的生成。结论:FH通过促进成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化来提高骨的形成,对开发抗骨质疏松症和骨关节炎等疾病的功能性食品有重要的意义。     

牛骨多肽螯合物的制备及结构表征

为生产易被人体高效吸收利用的补钙剂以及提高牛骨的利用率,对实验室自制的牛骨多肽进行钙螯合处理,以螯合率、钙质量分数为考察指标,确定制备方法;采用紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、扫描电子显微镜、粒径及稳定性分析比较螯合前后的变化。结果表明:制备肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2∶1、温度60℃、时间40 min、pH 8.0。在此条件下,螯合率达到38.97%,钙质量分数为21.29%。对最佳条件下的多肽螯合物进行光谱结构分析,结果表明氨基与羧基参与螯合反应,且二者之间主要发生配位反应;扫描电子显微镜表明螯合后分子发生聚集,结构更加紧密。实验制备的肽钙螯合物,具有潜在保健价值。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白制备工艺优化及其促骨形成作用研究

以14种水产动物卵为原料,筛选出具有较高促前成骨MC3T3-E1细胞增殖活性的鲫鱼卵水溶性糖蛋白,采用响应面法优化了鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(Sialoglycoprotein of Carassius auratus eggs,Ca-SGP)的提取工艺,并评价Ca-SGP对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。结果表明,14种水产动物卵中,鲫鱼卵糖蛋白唾液酸含量最高,且对MC3T3-E1细胞增殖率最高,分别为5.76%和145.71%;采用单因素和响应面试验优化得到制备Ca-SGP的最优提取工艺为:NaCl浓度为0.38 mol/L、提取时间为4.2 h、液料比为1:3.88 w/v,在此条件下,Neu5Ac得率的预测值为592 mg/100 g,验证值为588.47 mg/100 g。Ca-SGP对骨形成作用的研究结果表明,Ca-SGP显著提高MC3T3-E1细胞增殖至135.56%,显著提高COL I、OCN和OPN的分泌量,分别提高到32.23、261.46和85.89 ng/mL,显著提高成骨细胞矿化能力至241.67%,说明Ca-SGP具有显著促骨形成作用(P<0.05)。以上研究为寻找安全、有效抗骨质疏松功能因子提供新途径。     

金枪鱼鱼骨活性钙对鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活力和凋亡作用

目的:以金枪鱼骨为原料,制备柠檬酸-苹果酸钙剂(CMC),研究其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的细胞活力、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)培养液中,分别加入高浓度(1 μg/mL)CMC和低浓度(0.1 μg/mL)CMC,利用MTT法检测对MC3T3-E1细胞活力的影响,流式细胞仪检测血清饥饿诱导的细胞凋亡。结果:高浓度和低浓度的钙对MC3T3-E1细胞活力均有显著的促进作用,24 h的高钙组的细胞增长率(9.67%)优于低钙组(8.95%);36 h和48 h后低钙组的增长率分别为14.96%和20.33%,明显优于36 h和48 h作用后的高钙组(6.23%和1.73%),两组细胞凋亡率与空白组比较差异较小,且均显著低于对照组(p<0.01)。结论:CMC高钙组和CMC低钙组在一定浓度范围内,能促进MC3T3-E1细胞活力显著增强,并且改善血清饥饿诱导的成骨前体细胞凋亡。     

响应面法优化龟甲蛋白提取工艺及其对MC3T3-E1细胞增殖活性

目的:优化龟甲蛋白提取工艺,筛选龟甲促成骨细胞（MC3T3-E1）增殖活性组分。方法:以蛋白含量及对MC3T3-E1细胞增殖率为指标筛选龟甲蛋白提取方法;以料液比、提取温度、时间为自变量,龟甲蛋白含量为因变量,进行单因素提取研究,结合响应面试验设计,获得提取龟甲蛋白最佳工艺;通过超滤技术将龟甲蛋白按分子量分为5个不同组分:总提组分（组分1）,Mw>10 kDa组分（组分2）,Mw:3~10 kDa组分（组分3）,Mw:1~3 kDa组分（组分4）,Mw<1 kDa组分（组分5）,CCK8法测定不同浓度龟甲蛋白（12.5、25、50、100、200 μg/mL）及其不同组分对MC3T3-E1细胞增殖率的影响。结果:磁力搅拌方法得到的龟甲蛋白含量最高,且活性最佳,龟甲蛋白最佳提取条件为料液比1:13（g/mL）、提取温度30℃、提取3 h,此条件下测得龟甲蛋白含量为15.16%;龟甲蛋白不同组分均能促进MC3T3-E1前成骨样细胞增殖,并呈浓度依赖性,在浓度为200 μg/mL时,组分1~5对细胞的增殖率分别为20.58%、25.30%、30.24%、37.89%、38.15%,分子量小于1 kDa的组分促MC3T3-E1细胞增殖活性最佳。结论:本研究为龟甲蛋白的制备工艺提供参考,并证明龟甲蛋白及其不同组分均具有较好的促成骨细胞增殖活性,其中分子量小于1 kDa组分对MC3T3-E1细胞增殖的效果最佳。     

大黄鱼蛋白肽-钙螯合物的制备及性质研究

目的 制备大黄鱼蛋白肽-钙螯合物,并研究其结构性质。方法 以大黄鱼鱼糜为原料,通过胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解制备多肽,将肽与钙进行螯合,探究大黄鱼蛋白肽及其肽-钙螯合物的性质功能。结果 3种酶解肽中,胰酶肽钙螯合含量最高,胰酶肽的粒径最小,肽-钙螯合物相比于肽的粒径都有所减小,说明肽-钙螯合物是一种致密的纳米颗粒并呈现出折叠多孔的网络结构。这些变化可归因于肽和钙离子之间的相互作用。紫外吸收光谱、荧光光谱、红外图谱和圆二色光谱的结果表明大黄鱼蛋白肽与钙离子螯合,生成了新的肽-钙螯合物。结论 3种酶解肽中,胰蛋白酶水解物的钙离子结合能力在3种蛋白酶获得的水解物中最高。因此,在本研究中胰蛋白酶被认为是制备大黄鱼蛋白水解物钙离子结合活性肽的最优酶制剂,为大黄鱼的高值化利用和新型钙制剂的开发提供了理论依据和实验参考。     

Activities of MC3T3-E1 cells cultured on gamma-irradiated salmon atelocollagen scaffold

We investigated the effect of gamma-irradiation on the activities of MC3T3-E1 cells cultured on gamma-irradiated salmon atelocollagen (SAC) scaffolds. SAC-cultured samples were irradiated at doses of 10, 15, and 25 kGy. Gamma-irradiation had a significant impact on the activities of MC3T3-E1 cells. The proliferation rates and alkaline phosphatase activities of MC3T3-E1 cells increased with gamma-irradiation dose.     

Effects of medicinal plant Atractylodes japonica on MC3T3-E1 cells

During our survey of the aromatic medicinal herbaceous plants looking for activity on bone metabolism, we found that Atractylodes japonica rhizomes increased the function of osteoblastic MC3T3-E1 cells. Chemical constituents of Atractylodes japonica were separated by hydro-distillation extraction (HDE), and characterized by GC/MS. The effects of Atractylodes japonica essential oils (AEOs) on the function of osteoblastic MC3T3-E1 cells were tested. AEO significantly (p<0.05) increased the growth and differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cells, indicating that has potential for use as a natural treatment for osteoporosis.     

卵黄高磷蛋白磷酸肽及其钙螯合物在双细胞共培养体系中对成骨细胞分化的促进作用

研究了卵黄高磷蛋白磷酸肽（Phosvitin Phosphopeptide,PPP）及其钙螯合物（PPP-Ca）在成骨细胞（MC3T3-E1）和破骨前体细胞（RAW264.7）共培养体系中对成骨细胞分化的调节作用。对细胞毒性、碱性磷酸酶（AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的活性和TRAP染色进行分析;用RT-PCR技术进一步探究成骨细胞RANKL/OPG通路相关蛋白的mRNA表达情况。结果发现,PPP和PPP-Ca可以使MC3T3-E1体系中的AKP活性分别增加9.5%和12.7%;PPP和PPP-Ca的加入可以使MC3T3-E1体系中OPG基因mRNA的表达量从0.92分别提升至1.25和1.39、使RANKL基因mRNA的表达量从1.00分别提升至1.23和1.45。该研究结果表明,PPP和PPP-Ca可有效促进成骨细胞的分化。实验结果为进一步探索磷酸肽在多细胞模型体系中的作用提供了研究基础,同时为磷酸肽的功能活性开发提供理论依据。