α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中稳定表达的策略

综述了宿主细胞的表达特点，外源基因的来源，表达载体和转化方法对α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中稳定表达的影响，并在此基础上提出了相应的策略。     

抗菌肽Japonicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上，经PCR鉴定及序列分析，所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap，结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

应用不同载体探索环二肽合成酶AlbC的高效可溶性表达

AlbC是一种环二肽合成酶，可用于合成具有抗菌性和抗肿瘤性的环二肽及后续衍生物。近年来，AlbC的产物在白酒及其副产物黄水中被相继检出，对赋予白酒健康功能起着至关重要的作用。为实现albC基因的高效可溶性表达，本研究以实验室保藏的枯草芽孢杆菌Y1为模板克隆出albC基因，构建了pQE30-albC,pET28a-albC,pET28a-SUMO-albC,pGEX-6P-1-albC 4个重组质粒，并探究了不同诱导温度下每个重组质粒的诱导表达情况。结果表明：（1）pQE30-albC不表达或者表达量低；pET28a-albC正确表达，但表达量和可溶性表达量都较低，纯化后融合蛋白浓度为1.0 mg/L;pET28aSUMO-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为30 mg/L，切除SUMO标签蛋白后浓度为22 mg/L;pGEX-6P-1-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为44 mg/L，切除GST标签蛋白后浓度为34 mg/L;(2)拥有GST促溶标签的pGEX-6P-1载体是4组载体中达到albC基因可溶性表达水平最高的载体；（3）在4种载体中...     

人乳铁蛋白在原核中的融合表达

设计了特异引物，通过PCR扩增人乳铁蛋白（HLF）基因，将扩增的DNA片段重组到原核表达载体pGEX-4T3中，重组体转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导后，得到了高效融合表达。分析结果表明，获得了特异表达的乳铁蛋白。     

毕赤酵母高效表达人乳铁蛋白的研究

将人乳铁蛋白全长基因克隆至酵母表达载体pPIC9K中，并建立hLF／pPIC9K／SMD1168酵母表达系统，在细胞高密度发酵条件下，乳铁蛋白表达量约1000mg／L，并具有天然蛋白相似的糖基化结构。本研究为商业化生产人乳铁蛋白提供了理论依据。     

基于哺乳动物细胞系的重组乙酰胆碱酯酶表达载体构建研究

：目的 构建具有不同信号肽、载体骨架元件以及乙酰胆碱酯酶编码基因序列的真核表达载体,为基于哺乳动物细胞系表达重组乙酰胆碱酯酶提供前期研究基础。方法 通过NCBI数据库查询苍蝇头部、电鳗鱼发电器官来源的乙酰胆碱酯酶基因序列(mdAChE和eleelAChE),经密码子优化后,选择Humaninsulin、小鼠重链、Human CD33 3种信号肽序列,将其与合成的上述目的基因连接后分别与pCMV3、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.4 3种载体骨架元件进行组合,构建重组乙酰胆碱酯酶的表达载体,随后分别在CHO-S、Expi293F细胞系中进行瞬时转染表达,产物采用镍柱亲和纯化后进行SDS-PAGE与WB分析鉴定。结果 经菌落PCR及DNA测序鉴定,成功构建了4种重组mdAChE酶的表达载体以及3种重组eleelAChE酶的表达载体。SDS-PAGE、western blot的结果表明,基于pcDNA3.1(+)和pcDNA3.4载体骨架元件的重组表达载体可实现重组mdAChE和eleelAChE酶的可溶表达;以pCMV3为载体骨架元件的表达载体,仅在以Human CD33为信号肽时,在CHO-S细胞系中实现重组mdAChE酶的可溶表达,其余情况下均未见有效表达。结论 实现了昆虫、鱼类来源的重组乙酰胆碱酯酶在哺乳动物细胞系的可溶性表达,发现载体骨架元件、信号肽类型对其重组表达具有重要影响,CHO-S以及Expi293F细胞均适合重组乙酰胆碱酯酶的表达,后续还需对影响其酶活、农药敏感性的关键限制性因素开展深入地研究。     

单核细胞增生李斯特菌ladR基因在两种原核表达载体中的克隆表达及纯化分析

利用特异性引物扩增ladR基因序列,分别构建单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ladR基因的两种原核表达载体,即含有6个His标签的pET-28a-ladR表达载体和含有GST标签的pGEX-4T-ladR表达载体。通过诱导时间、温度和浓度优化两种表达载体的蛋白表达条件,比较分析两种表达载体的LadR蛋白可溶性表达水平,利用Western-Blot进行LadR蛋白表达验证。本研究成功构建了pET-28a-ladR和pGEX-4T-ladR表达载体,在大肠杆菌BL21中分别表达出His-LadR和GST-LadR融合蛋白。通过凝血酶切除GST标签,纯化后得到LadR蛋白。在最佳表达条件IPTG为0.5 mmol/L,22 ℃诱导过夜下,pGEX-4T-ladR表达载体中LadR的表达量比pET-28a-ladR（IPTG为1.0 mmol/L,22 ℃诱导过夜）中His-LadR蛋白的表达量高4.48倍。本研究结果表明,GST标签有利于ladR基因的可溶性表达,为后续的LadR蛋白的功能分析和转录调控机理研究奠定了良好基础。     

根癌农杆菌介导酸性蛋白酶在泡盛曲霉中表达的研究

利用Gateway克隆技术快速构建丝状真菌表达载体,以米曲霉α-淀粉酶A启动子(amyB)、α-糖苷酶终止子(agdA)及黑曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)分别构建入门载体,以带有潮霉素抗性标记(hygB)的农杆菌双元载体pHGW为目的载体,通过LR连接反应,构建根癌农杆菌介导丝状真菌重组表达载体pHGW-apA。转化泡盛曲霉宿主菌,筛选的转化子经传代培养确定其遗传稳定性,PCR及测序分析表明,hygB和目的基因pepA整合到了泡盛曲霉基因组。转录水平上的RealTime-PCR定量分析、表达水平上的Western Blotting分析以及培养液酶活分析表明酸性蛋白酶基因pepA在泡盛曲霉中得到正确表达。为丝状真菌表达载体快速构建与外源基因在丝状真菌中快速表达提供了可行的方法。     

大豆过氧化物酶基因的克隆及其表达载体的构建

大豆过氧化物酶(soybean peroxidase,sbp)基因的克隆及其表达载体的构建将有利于人们更深入的从分子生物学角度研究sbp 基因的结构与功能。首先从大豆根中获取总RNA,通过RT-PCR 获得sbp 基因。再将sbp 基因与表达载体pPICZα-A 双酶切后连接,构建重组表达载体pPICZα-A-sbp。将pPICZα-A-sbp 转化大肠杆菌筛选阳性克隆体并测序。结果表明：获得的sbp 基因序列与已报道的sbp[U51191(GmEpa1)]基因序列有92% 的同源性。重组表达载体pPICZα-A-sbp 的成功构建为其在毕赤酵母中表达奠定了基础。     

编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌（既cherichia coli）中扩增出1．16kb的编码1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，将其连接到温控表达载体pHsh，得到重组哉体pHsh-yqhD，重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS-PAGE分析显示：融合表达产物的相对分子质量均为43000，同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yghD的基因工程菌进行表达研究表明：42℃诱导4h，1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到100IU／mg，而对照菌株的酶活力仅为0．5IU／mg。     

钝齿棒杆菌产精氨酸代谢途径中argB基因的扩增及其序列分析

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032序列,设计并合成一对引物,获得了全长argB基因片段.将其克隆到pGEM T Easy载体中,经测序鉴定后,以其为DIG标记探针,通过SouthernBlot分析钝齿棒杆菌A.S1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC13032,argB基因核苷酸同源性高达99%,氨基酸序列95%相同.     

优良醋酸菌种AC2005的鉴定

将醋酸杆菌AC2005 16S rDNA片段转入载体pMD18-T,并转化大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli).经测序和序列分析显示,醋酸杆菌AC2005 16S rDNA片段与巴斯德醋杆菌16S rDNA片段同源性均达95%.根据醋酸杆菌AC2005 16S rDNA的生理生化特征培养特征,形态特征结果将醋酸杆菌AC2005归属为巴斯德醋酸杆菌罗旺亚种(Acetobactor.pasteurianus subsp.lovaniensis).     

Generation of Reference Material by the Use of Multiple Displacement Amplification (MDA) for the Detection of Genetically Modified Organisms (GMOs)

The identification of genetically modified (GM) organisms (GMOs) in unknown samples by polymerase chain reaction (PCR) requires the use of a positive control sample, containing the target sequence derived from the respective GMO. For this purpose, either DNA extracted from suitable reference material or plasmids bearing the sequence are used. In the case of isolated genomic DNA, the preparation is cost-intensive and time-consuming, and material availability may be limited. Once the sequence is cloned into a plasmid, it may be simpler and less cost-intensive to purify the DNA, but contamination risk is substantially higher. The potential of multiple displacement amplification (MDA) as a new tool to generate reference material for GMO detection was studied taking the GM maize MON810 as a case. MDA yield of maize-specific DNA and amplification efficiency in dependence of the amount of starting material were estimated using real-time PCR. Applicability of the amplified DNA for the use as reference material was tested with regard to real-time PCR performance and MDA bias. Depending on the amount of genomic DNA (gDNA) input into MDA, amplification rates in the range of 30-fold (100 ng input of gDNA) to 23,000-fold (0.1 ng input of gDNA) were achieved. Real-time PCR performance and gene representation of amplified DNA (mdaDNA) are comparable to those of gDNA. Our results demonstrate that the DNA amplified by MDA is suitable for the use as reference material for qualitative GMO analysis.     

质粒DNA经胃肠道吸收整合宿主基因组的可能性评价

给小鼠灌胃裸pcDNA3s质粒DNA,于3周后提取小鼠肺、肾、脾、肠系膜淋巴结、胸腺、生殖器官、肌肉及肝脏组织中的总DNA,琼脂糖凝胶分离游离质粒DNA与基因组DNA,以组织基因组DNA为模板,PCR法检测质粒DNA的整合率.对照模板中加入不同拷贝数的pcDNA3s质粒,确定PCR反应的敏感性.结果表明,各组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,低于PCR反应的最低检出率.pcDNA3s质粒可能整合入宿主基因组的拷贝数是基因自发突变率的1/3000,尚未发现外源质粒DNA经胃肠道途径整合入宿主基因组的证据.     

嗜热链球菌胸苷酸合成酶基因的克隆与序列分析

本研究以嗜热链球菌(S．thermophilus)染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增出胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,thyA)基因,将其克隆入T载体中,转化DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定,PCR扩增鉴定,进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了thyA基因,全长900bp,与国外报道的S．thermophilus ATCC19258 thyA基因同源性达99．9%。这为构建以thyA基因为选择压力的非抗生素抗性载体提供了理论依据。     

吸水链霉菌valG基因的克隆与表达

为提高井冈霉素A的产量,本实验尝试构建吸水链霉菌的多拷贝基因菌株.根据吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis）的糖基转移酶基因（valG）序列设计了1对引物.PCR扩增编码糖基转移酶（ValG）的1269 bp基因后,利用TA克隆构建克隆质粒pMD-19-valG.测序正确后经双酶切构建穿梭质粒pIJ8630-valG.再次测序验证后,经质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞将pIJ8630-valG导入吸水链霉菌中.PCR检测证实重组菌构建成功.HPLC检测发酵产物,发现井冈霉素A的产量达到了1.17 mg/mL,比出发菌株提高了11.2％,valG基因得到表达,为进一步利用valG构建新的高产菌株奠定了基础.     

Genetic transformation of auxotrophic mutants of the filamentous yeast Trichosporon cutaneum using homologous and heterologous marker genes

A transformation system for the filamentous yeast Trichosporon cutaneum based on auxotrophic markers is presented and techniques for the induction, isolation and characterization of mutants are described. A number of auxotrophic mutants were isolated and characterized by using biosynthetic precursors and/or inhibitors. A mutant unable to grow in the presence of ornithine could be complemented successfully by spheroplast transformation experiments using the cloned Aspergillus nidulans ornithine transcarbamoylase gene (argB gene) as selection marker with an efficiency of 5-100 transformants per microgram of DNA. In these transformants the heterologous argB gene was present in multiple tandem copies and the transforming DNA was found to remain stable after more than 50 generations in non-selective media. The same mutant could be complemented by a T. cutaneum cosmid gene library and a complementary cosmid was subsequently isolated from this library by a sib-selection strategy. This cosmid transformed T. cutaneum spheroblasts with an efficiency of 50-200 colonies per microgram of DNA. Southern blot analyses were consistent with the view that the transforming sequences became stably integrated into the host genome at the homologous site.     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

重组牛乳铁素融合表达质粒的构建及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR 技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120 的DNA 聚合酶基因dnaENI 中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn 的PCR 产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a 构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp. PCC 7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。     

野油菜黄单胞菌产胶基因GumD克隆与重组质粒的构建

目的:建立野油菜黄单胞菌产胶基因GumD的克隆与重组质粒构建的方法。方法:以优化PCR实验条件扩增得到野油菜黄单胞菌产胶基因GumD片断,与抗药性质粒pMD18-T连接,获得重组质粒,并用CaCl2法转化JM109大肠杆菌细胞。结果:DNA测序结果表明,成功克隆产胶基因和构建重组质粒。结论:此方法可用于克隆野油菜黄单胞菌产胶基因和构建产胶基因重组质粒。