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相似文献
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1.
目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区11kD蛋白,并检测表达产物的效力。方法构建11kD蛋白编码基因原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,离子层析柱分离纯化重组蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌11kD蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白占总菌体蛋白的33%以上,纯化后纯度达95%以上,并可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,5μg/ml11kD蛋白的效力与50IU/ml TB-PPD相当。结论重组11kD蛋白已在大肠杆菌中成功表达,并有望成为结核病皮试鉴别诊断用新试剂。  相似文献   

2.
目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。  相似文献   

3.
目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6构建正确。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95%以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应。制备的VP6蛋白多克隆抗体效价1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白。结论原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础。  相似文献   

4.
目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5~1.0和1.0~1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。  相似文献   

5.
目的比较轮状病毒(rotavirus,RV)在不同细胞上的培养效果,确定RV最适培养细胞株。方法采用原代牛肾细胞(PCKC)、MA104细胞、CV-1细胞、Vero细胞4种细胞培养RV,观察RV在不同细胞培养过程中细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并检测病毒收获液的病毒毒力及病毒RNA。结果 MA104和PCKC细胞较适宜RV的增殖培养,其次是CV-1细胞,而Vero细胞感染病毒后3 d才出现CPE,6 d才有约75%的细胞圆缩死亡,这时收获的病毒液滴度也不及前3种细胞的病毒收获液滴度,且收获液的病毒RNA电泳的条带较模糊。结论 MA104、PCKC、CV-1细胞较适宜RV的增殖培养,而应用于大规模生产疫苗的Vero细胞培养RV要想达到前3种细胞的效果,还需进一步完善感染和培养方法。  相似文献   

6.
PCR扩增人Ⅰ型精氨酸酶基因(hAⅠ),插入大肠杆菌表达载体pET30a中,构建重组表达质粒pET30a-hAⅠ,转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),构建大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)(pET30a-hAⅠ),IPTG诱导后表达,菌体酶活为每克湿菌体34.6 U.SDS-PAGE分析表明,诱导后的BL21(DE3)(pET30a- hAⅠ)在约35 kD处有明显的蛋白表达.  相似文献   

7.
从抗 HCV和HCVRNA均为阳性的病人血清中 ,采用RT PCR技术扩增得到HCVNS5基因片段。用含此基因片段的重组质粒pET 2 8a转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后可高效表达NS5蛋白。该蛋白可用固定化金属离子螯合层析法 (IMAC)纯化。经Westernblot和ELISA检测结果表明 ,纯化的NS5蛋白可与丙型肝炎患者血清发生特异反应 ,在HCV感染的诊断中可能具有良好的应用前景。  相似文献   

8.
目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。  相似文献   

9.
目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。  相似文献   

10.
目的 以鸡脾细胞mRNA为模板扩增编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 用PHA和LPS激活的AA肉鸡脾细胞 ,提取mRNA ,以RT PCR法扩增出编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA并测序 ,与pET 2 8b载体构建重组质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE检测表达产物。结果 所克隆的核苷酸片段包含了鸡IL 18全部成熟蛋白编码基因 ,其大小为 5 0 7个核苷酸 ,编码 16 9个氨基酸 ;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量为 190 0 0的重组蛋白。结论 已成功克隆和表达了鸡IL 18成熟蛋白基因。  相似文献   

11.
C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。  相似文献   

12.
目的在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F(rmIL-17F),并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。  相似文献   

13.
目的原核表达重组铁载体受体蛋白IroN,并探讨其对小鼠肠道外致病性大肠杆菌群(Extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)感染的免疫保护作用。方法从E.coliJ96基因组DNA中扩增IroN基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a-IroN,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组IroN蛋白纯化后,经皮下免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和尿液中的抗体水平;以E.coliJ96菌株分别经腹腔和尿道途径攻击免疫小鼠,计算保护率并计数细菌数。结果重组IroN蛋白的表达量为32%,纯化后纯度超过85%,且具有良好的反应原性。重组IroN蛋白经皮下免疫小鼠,可诱导小鼠血清产生高水平的特异性IgG抗体,在尿液中未检测到特异性IgA抗体。重组IroN蛋白对腹腔攻击ExPEC感染小鼠的保护率为81.8%(P<0.05);重组IroN蛋白免疫的小鼠经尿道攻击ExPEC后,肾脏分离的菌落数比对照组(PBS免疫)降低了100倍以上(P<0.05),但膀胱和尿液中的菌落数两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论已原核表达并纯化了IroN蛋白,其对ExPEC感染小鼠的腹腔和肾脏具有显著的保护作用,但对膀胱感染无保护作用。  相似文献   

14.
目的在大肠杆菌中异源表达东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK CTa,并观察其对宿主菌增殖的影响。方法构建BmK CT基因原核表达质粒pExSecI-rBmK CTa,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。光密度法检测含不同质粒的大肠杆菌BL21(DE3)及空菌在37℃,LB液体培养基中的生长速率。结果重组原核表达质粒pExSecI-rBmK CTa经PCR、双酶切和测序证明构建正确。目的蛋白的表达量占全菌总蛋白的19.94%,为可溶性表达,且具有良好的反应原性。rBmK CTa的异源表达显著抑制了大肠杆菌在对数生长期的增殖。结论rBmK CTa在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,且对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。提示BmK CT可能特异性地作用于宿主菌的氯离子通道,对原核生物的氯离子通道有抑制作用。  相似文献   

15.
目的原核表达乙型脑炎病毒(JEV)NS1和E蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白基因片段,分别克隆入原核表达载体pET-30a(+)和pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-30NS1和pET-32Et,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达水平。两种蛋白经亲和层析纯化后,Western blot鉴定其反应原性。通过小鼠主动和被动保护力试验及豚鼠病毒血症试验,检测两种蛋白的免疫原性。结果酶切及测序证明重组表达质粒构建正确;表达的重组NS1和E蛋白的相对分子质量分别约为40000和47000,均以包涵体形式表达;纯化的重组NS1和E蛋白的浓度分别为160.7和380μg/ml,均具有良好的反应原性;小鼠主动和被动保护力试验表明两种蛋白均有保护活性;豚鼠病毒血症试验显示,NS1蛋白免疫豚鼠后能明显抑制病毒血症的产生。结论已成功表达并纯化了JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白,两种蛋白均有较好的免疫保护活性。  相似文献   

16.
目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。  相似文献   

17.
目的 获得汉坦病毒重组核蛋白 ,并将其应用于血清学诊断。方法 采用PCR方法 ,从带有HTN型Z10株病毒全长核蛋白基因的质粒上扩增读码框的前 35 4bp的核蛋白基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入表达载体pGEX 2 0T ,得到重组质粒pGEX2 0 Z10trNP ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,表达产物经Glu tathioneSepharose 4B柱纯化 ,并进行抗原性及抗原特异性检测。结果 pGEX2 0 Z10trBP表达产物是相对分子质量约为 4 0 0 0 0的谷光甘肽转移酶 (GST)融合蛋白GST Z10trNP。经Westernblot分析 ,GST Z10trNP具有良好的抗原性。用纯化GST Z10trNP为抗原 ,用ELISA间接法检测出血热病人血清、出血热疫苗免疫的家兔及小鼠血清 ,均能很好地区分阴性和阳性血清。结论 GST Z10trNP表达量高 ,易于纯化 ,并且具有良好的抗原性及抗原特异性 ,是一种安全、廉价的诊断抗原。  相似文献   

18.
表达MAGE-1/HSP70/MAGE-3工程菌的稳定性   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的检测重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状的稳定性。方法将工程菌菌株连续传50代,每隔10代挑取单克隆菌落进行诱导表达,并计算质粒丢失率。提取不同代次的质粒,扫描电镜观察,检测融合蛋白表达水平,并进行工程菌的染色镜检及生化鉴定。结果pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)融合蛋白工程菌呈典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状稳定,可作为生产用菌种。  相似文献   

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