中国人MBL基因编码区的克隆与原核表达

目的克隆中国人MBL基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法提取肝总RNA,RT-PCR扩增MBL编码区序列,并克隆到pGEM-T-easy载体上,再亚克隆到pET-30(a)上。诱导表达重组MBL,并通过SDS-PAGE检测表达情况,表达蛋白经初步纯化后,用ELISA及点杂交试验检测其免疫原性。结果克隆得到长747bp的MBL编码区序列,与GenBank中的MBL序列同源性在99%以上。重组MBL相对分子质量约为36000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的20%左右,表达蛋白经初步纯化,纯度可达95%以上。ELISA检测显示重组MBLA490值与阴性对照差异有显著意义(10倍以上),点杂交检测结果为阳性。结论已成功克隆中国人MBL基因的编码区序列,并在大肠杆菌中表达,表达产物与天然MBL具有相似的免疫原性。     

小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达。结果重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确。表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠sIL-5Rα单抗发生特异性免疫反应。结论已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK-Br3细胞系中扩增出387bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高;纯化后重组蛋白浓度为1.5mg/ml。结论已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原。     

人溶菌酶基因的原核表达及其生物学活性

目的在大肠杆菌中表达人溶菌酶(hLYZ)基因,并检测其生物学活性。方法将人溶菌酶基因克隆至带有GST融合标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并用溶壁微球菌比浊法检测酶活性,热激法检测其生物学活性。结果经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒pGEX-4T-hLYZ构建正确。SDS-PAGE显示,在相对分子质量约40000处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的46.5%,目的蛋白在裂解沉淀中占17.0%,在裂解上清中占58.3%,主要以可溶形式表达。纯化后,重组蛋白纯度可达95%以上,且具有良好的反应原性。重组hLYZ酶活性为2389U/mg,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性重组人溶菌酶,且具有较高的生物学活性。     

人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆人热休克蛋白70(HSP70)基因,构建其原核高效表达载体。方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆,提取质粒pE28b70F,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目标蛋白。结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70,表达量约占细菌总蛋白的22·3%,其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12%。Westernblot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。通过Ni2+-NTA亲和柱,从1L诱导产物中纯化出约1520mg重组蛋白,纯度在80%以上。结论已成功表达HSP70,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

代谢型谷氨酸受体4胞内段的原核表达及纯化

目的原核表达代谢型谷氨酸受体4胞内段(metabolic glutamate receptor 4 intracellular,GRM4 intracellular,GRM4 intra),并用Ni柱进行纯化。方法采用PAS(PCR-based accurate synthesis)法合成GRM4 intra基因序列,将目的片段和质粒p Czn1双酶切后,经连接,构建重组质粒pCzn1-GRM4 intra;将重组质粒转化至Rosseta菌株,IPTG诱导GRM4 intra蛋白的表达,表达的蛋白利用Ni柱亲和层析法纯化。结果经测序和双酶切鉴定证明质粒pCzn1-GRM4 intra构建正确;在IPTG诱导下,质粒能够在Rosseta菌株中高效表达,表达的蛋白相对分子质量约18 400,主要以可溶性性形式存在,纯度> 90%。结论成功获得了原核表达的GRM4 intra蛋白,为利用体外pull down方法鉴定GRM4的相互作用蛋白提供了参考。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定

目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。结果PCR扩增约770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

扩展青霉碱性脂肪酶结构基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)结构基因。方法提取扩展青霉总RNA,经RT-PCR扩增PEL结构基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-PEL,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,包涵体蛋白经变性、复性后,采用NaOH滴定法测定其酶活性。结果经RT-PCR扩增获得约780bp的PEL结构基因;所构建的重组表达质粒pET-28a-PEL经酶切及PCR鉴定正确;目的蛋白的相对分子质量约为28000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;发酵液及复性的包涵体蛋白酶活性可达12.44U/ml。结论已成功克隆并原核表达了PEL结构基因,为获得碱性脂肪酶高产基因工程菌株奠定了基础。     

人67KDa层连蛋白受体前体蛋白的基因克隆、表达及其免疫原性

［摘 要］目的 克隆、表达人67KDa层连蛋白受体前体蛋白（67KDa laminin receptor precursor,LRP）并检测其免疫原性。方法 应用RT－PCR从胃癌细胞9GC7901中扩增编码LRP的cDNA,将其按照T-A克隆法重组入pUCm－T载体并进行DNA序列测定。采用DNA重组技术构建原核表达载体pQE30-LRPP;用M15/pQE系统表达6×组氨酸与 LRP的融合蛋白,并以 SDS－PAGE和Western blot鉴定所获融合蛋白。用含融合蛋白的聚丙烯酸胺凝胶颗粒免疫小鼠,以 Westem blot检测小鼠血清的抗体活性。结果 DNA测序结果证实所扩增的cDNA片段与 LRP的基因序列完全相符。SDS－PAGE检测显示,经IPTG诱导2h后,M15/pQE30－LRP总蛋白中出现一条34KDa的新生蛋白带,Western blot进一步证实该新生蛋白为融合蛋白。其免疫小鼠血清经 Western blot检测仅识别SGC7901细胞中一条大小约为42KDa的蛋白带;其血清即使被稀释2000倍,仍然显示与靶蛋白有较强的结合活性。结论 成功地克隆、表达了人LRP,并具有良好的免疫原性。