用人外周血线粒体DNA4977bp缺失检测辐射损伤初探

初步探索用聚合酶链反应(PCR)方法进行辐射诱导的线粒体DNA4977bp缺失分析的可行性。对正常人外周血进行2Gy^60Coγ射线的照射,照射后提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,用PCR方法进行线粒体DNA4977bp缺失分析,同时扩增很少缺失的线粒体DNA片段(16S-ND1);进而比较照射前后线粒体DNA 4977bp缺失水平。结果表明,用于分析线粒体DNA 4977bp缺失的引物对在最佳试验条件下,可特异性扩增出所有2Gy照射诱导的线粒体DNA 4977bp缺失;该扩增产物经纯化、测序和核苷酸同源性分析,证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的8470-13446bp。用于扩增16S-ND1的引物对在很大的温度变动范围内,均能扩出目的DNA片段。所有外周血样品在照射前无线粒体DNA 4977bp缺失,2Gy^60Coγ射线照射后特异诱导出此缺失。说明用本研究中建立的PCR方法,可用来分析电离辐射诱导的外周血有核细胞线粒体DNA 4977bp缺失水平。     

人外周血线粒体 DNA4934bp自发缺失及60Coγ射线诱发缺失的剂量效应关系初探

为探索正常人群外周血样品中线粒体DNA(mtDNA)4934bp缺失的发生比例及电离辐射是否可以诱发该缺失,对109例正常人外周血样品进行分析,确定正常人外周血样品中发生该缺失的比例,将3例缺失阳性正常人外周血样品,使其受到0、2和6Gy 60Co γ射线照射,对4934bp缺失发生情况进行研究;经分析发现,41%的正常人外周血样品具有该缺失,聚合酶链反应PCR产物经克隆、测序和核苷酸同源性分析证实该缺失发生在线粒体DNA重链nt8435-nt13368之间.自发缺失发生比例与供者年龄增长相关(p<0.01),与性别无关.使用半定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),缺失阳性正常人外周血样品在接受0、2和6Gy γ射线照射后,检测其mtDNA 4934bp的缺失情况,发现在照射前后外周血线粒体DNA均有该缺失;以正常人外周血所做的半定量分析发现在照射0、2和6Gy后该缺失水平分别为23、25和27.说明电离辐射诱发人外周血样品缺失水平随剂量增加而增高.     

X射线致人外周血线粒体DNA 4977bp缺失的时效关系研究

采集2名25岁健康男性外周血进行不同剂量（0～10 Gy）单次X射线照射,于照后取不同时间点（2、12、24、48和72 h）培养的细胞提取基因组DNA,利用实时定量PCR检测不同时间点线粒体DNA（mtDNA）4977bp缺失情况,探讨X射线致人外周血mtDNA 4977bp缺失的时间效应关系。结果表明,受照剂量为5 Gy时,随着照射后培养时间的增加,mtDNA 4977bp缺失拷贝数、mtDNA总拷贝数和mtDNA 4977bp缺失率均有增加趋势。培养时间为24 h和72 h时,在0～10 Gy剂量范围内mtDNA 4977bp缺失拷贝数、mtDNA总拷贝数和mtDNA 4977bp缺失率随着受照剂量的增加而增加。提示X射线诱发的mtDNA 4977bp缺失和mtDNA总拷贝数具有时间和剂量累积性。     

电离辐射致人外周血有核细胞mtDNA 4977bp缺失水平分析

采集6名正常人外周血,体外进行60Coγ射线单次照射,剂量分别为0、1、2、3、4和5 Gy。照射后2小时采用实时定量PCR方法检测60Coγ射线诱发的人外周血有核细胞mtDNA 4977bp缺失(ΔmtDNA4977)和mtDNA总拷贝数(mtDNAtotal),探讨用ΔmtDNA4977为指标进行辐射事故生物剂量估算的可能性。结果表明,在0～5 Gy照射剂量范围内,6名健康人mtDNA样品中的mtDNAtotal拷贝数、ΔmtDNA4977拷贝数和ΔmtDNA4977缺失率在照射后明显高于未照射(0 Gy)的mtDNA样品(p0.05),但各照射剂量组间未见明显差异(p0.05)。提示电离辐射能够诱发人外周血mtDNA样品中4977bp缺失的累积和mtDNA总拷贝数的增加,但ΔmtDNA4977水平与受照剂量间未见明显的剂量-效应关系。     

~(60)Co γ射线诱导线粒体复合体Ⅰ亚基因表达改变的研究

为探讨电离辐射对人淋巴细胞线粒体复合物Ⅰ亚基因表达的影响,采用1、3、5、8和10Gy~(60)Co γ射线分别照射指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8h后利用逆转录PCR(RT-PCR)摸索各基因的最佳实验条件,进而利用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法定量检测各基因表达变化,观察辐射对复合物Ⅰ基因表达影响的剂量效应关系;同时以5Gy~(60)Co γ射线照射人淋巴细胞后,分别于不同时间点(0.5、4、8、12、24、48和72h),同样通过RT-PCR和Real-timePCR方法检测各基因表达的变化,观察其时效关系。结果表明,在mRNA水平上,线粒体复合物Ⅰ基因表达总体上调。剂量效应关系方面,ND2基因在8Gy剂量范围内呈现出随剂量增加基因表达增强的趋势;时效关系方面,7种亚基均在5Gy剂量照射后4h左右表达增强最显著,且大部分基因可持续高表达至48或72h左右。说明电离辐射可以诱导人淋巴细胞线粒体复合物Ⅰ基因表达的改变,表达总体上调。     

~(60)Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达改变的研究

用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)探讨了60Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达的改变。以1、3、5、8和10Gy60Coγ射线分别照射指数增长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8h后利用逆转录PCR(RT-PCR)摸索各基因的最佳实验条件,进而利用Real-timePCR的方法定量检测各基因表达变化,观察辐射对Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达影响的量效关系;同时以5Gy60Coγ射线照射人淋巴细胞后,分别于不同时点(0.5、4、8、12、24、48和72h),通过RT-PCR和Real-timePCR方法检测各基因表达的变化,观察其时效关系。结果发现,在mRNA水平上,线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达总体上调。Cytb和ATPase8基因在8Gy剂量范围内,呈现出随剂量增加基因表达增强的量效关系趋势;观察时效关系,发现5Gy剂量照射后4h左右,3种基因表达增强最显著,且Cytb和ATPase8基因分别持续高表达至48h和72h。因此,60Coγ射线可以诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达的改变,总体上呈现表达增强趋势。     

60Co γ射线照射人肝癌细胞诱导PIF1基因mRNA变化

分别用2 Gy和4 Gy ⁶⁰Co γ射线照射人肝细胞HepG2,利用real-time PCR方法检测PIF1基因mRNA表达量的变化,以探讨PIF1基因是否参与电离辐射致DNA损伤应答。结果表明,不同剂量的γ射线照射HepG2细胞后,PIF1 mRNA表现出一致的变化规律:即照后先轻微降低随后一直高表达,高表达至少持续到照射后12 h。提示电离辐射能够诱导PIF1表达,表达水平与剂量、时间相关。     

用基因芯片技术分析不同剂量60 C0γ射线照射后淋巴细胞株的差异基因表达谱

用基因芯片来筛选不同剂量辐射诱导的差异表达基因,为快速生物剂量指标的筛选提供科学依据.用0.5、3和8Gy60Coγ射线照射指数增长期的淋巴细胞永生化细胞株,24h后提取细胞总RNA、反转录成cDNA、标记后用基因芯片筛选各剂量点的差异表达基因;并用实时荧光PCR对某些基因表达水平进行定量分析.结果发现,0.5、3和8 Gy剂量组分别有16、240和462个差异表达基因,其中在三个剂量组均上调或下调的基因分别为4个和3个.对TP5313基因进行实时荧光PcR定量分析,结果与芯片结果一致.电离辐射诱导的TP5313、GDFl5、CDC43EP5、S100A4、IGJ和KLF2等基因的mRNA表达水平变化有可能与照射剂量有关.     

用基因芯片技术分析不同剂量60Coγ射线照射后淋巴细胞株的差异基因表达谱

用基因芯片来筛选不同剂量辐射诱导的差异表达基因,为快速生物剂量指标的筛选提供科学依据。用0．5、3和8Gy60Coγ射线照射指数增长期的淋巴细胞永生化细胞株,24h后提取细胞总RNA、反转录成cDNA、标记后用基因芯片筛选各剂量点的差异表达基因;并用实时荧光PCR对某些基因表达水平进行定量分析。结果发现,0．5、3和8Gy剂量组分别有16、240和462个差异表达基因,其中在三个剂量组均上调或下调的基因分别为4个和3个。对TP5313基因进行实时荧光PCR定量分析,结果与芯片结果一致。电离辐射诱导的TP5313、GDF15、CDC43EP5、S100A4、IGJ和KLF2等基因的mRNA表达水平变化有可能与照射剂量有关。     

褪黑素对电离辐射所致C57BL/6J小鼠免疫功能损伤的防护作用

探讨了褪黑素(Melatonin,MLT)对电离辐射诱导小鼠免疫功能损伤的影响及其机制.采用C57BL/6J小鼠,腹腔注射MLT后60min给予2Gy X射线全身照射,观察照射后24h其胸腺、脾淋巴细胞数量及胸腺细胞3H-TdR掺入率和Con A、LPS诱导的脾T、B淋巴细胞转化率的变化.结果表明,2Gy X射线全身照射后24h,小鼠胸腺、脾淋巴细胞数量、胸腺细胞3H-TdR掺入率及有丝分裂原诱导的脾T、B淋巴细胞转化率均显著低于假照组(p＜0.001).以MLT 0.5-10mg@kg-1体重预先腹腔注射,受照射小鼠免疫功能发生如下变化:胸腺、脾淋巴细胞数显著高于0mg组(单纯照射).其中,0.5mg组增高最显著;胸腺细胞3H-TdR掺入率显著增高(p＜0.01或p＜0.001),以0.5mg组增高最显著;ConA诱导的T淋巴细胞转化率显著增高,也以0.5mg组为最显著;细菌脂多糖(LPS)诱导的B淋巴细胞转化率增高,以10mg组最显著.此外,2.5mg组MLT可增强无丝裂原诱导的脾淋巴细胞转化率.MLT可减轻电离辐射诱导的小鼠淋巴细胞损伤,对免疫功能具有保护作用.     

纳米粒子PCR产物的纯化及AFM观察

适量浓度的纳米金可显著改善PCR扩增的特异性,提高扩增的灵敏度和反应速度。本文比较了不同方式处理纳米金优化后扩增产物的纯化效率,同时利用原子力显微镜（AFM）表征了扩增产物的形貌。结果表明,直接纯化纳米粒子PCR产物的纯化效率较高,且纳米金不会对大量扩增产物造成影响,但可能影响少量DNA的形貌;在乙醇沉淀DNA之前的高速离心步骤,虽纯化效率略为降低,少量DNA依然会随纳米金共沉降,但可有效排除扩增产物中的纳米金。     

^60Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用60Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义.用60Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化.结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系.5Gy剂量60Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低.PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要.     

用随机扩增多态性DNA技术对重离子辐照大丽花花色突变体的初步研究

品系为"大雪青"的大丽花幼枝,经兰州重离子加速器提供的80MeV/u 12C6 辐照后,种植在甘肃省定西市临洮新兴花卉公司基地.辐照8Gy的幼枝有一株花色突变体,用随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术对突变体和野生型进行检测分析.琼脂糖凝胶电泳结果表明,所用的10条引物中,有7条引物共扩增出78条带,其中5条引物扩增出了11条多态性片段,从而在DNA水平上证实了两者之间存在着差异,为进一步探讨重离子诱变机理打下基础.     

小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系

探讨细胞凋亡在小鼠脾脏辐射损伤与重建中的作用及其机制,为急性放射病的防治提供依据.用原位末端标记、DNA电泳和免疫组化技术观察经2～8Gy不同剂量γ射线整体照射后,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的动态变化过程和Bax、Bcl-2蛋白在其中的作用.结果表明,(1)照射后早期淋巴细胞凋亡率迅速增加,如6Gy照射后4h和1d凋亡率分别为对照值的4.9和9.7倍;凋亡率还随照射剂量的增加而迅速升高,照射后8h当照射剂量为2、4、6、8Gy时,凋亡率分别为对照值的3.7、5.4、6.2和8.3倍.(2)透射电镜观察表明,6Gyγ-线照射后,小鼠脾脏淋巴细胞出现早、中、晚期典型凋亡细胞的形态学特征.DNA凝胶电泳显示6Gy照射后4和6h,脾脏淋巴细胞出现特征的DNA梯形谱;末端标记法显示6Gy照射后4h凋亡率约为照前值的3.4倍.(3)照射后Bax、Bcl-2蛋白的异常表达证实两者在淋巴细胞凋亡的调控中起重要作用.细胞凋亡参与了小鼠脾脏辐射损伤与修复的全过程,Bax和Bcl-2蛋白对淋巴细胞凋亡的调控起重要作用.     

电离辐射对体外培养肾小管上皮细胞1α羟化酶表达的影响

研究电离辐射对体外培养肾小管上皮细胞1α羟化酶表达的影响。采用实时荧光定量（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,Real—time Q—PCR）技术与透射电镜等方法,观察3Gy、5Gy和10Gy ^137Csγ,射线单次照射（剂量率为0．85Gy／min）体外培养肾小管上皮细胞后1α羟化酶mRNA表达水平及细胞线粒体形态的改变,并与不受照（0Gy）组比较。结果表明,低剂量（3Gy）γ射线照射24h后即出现肾小管上皮细胞1α羟化酶mRNA表达水平的明显降低（p〈0．05）,且随受照剂量的增加下降幅度增大;电镜观察显示受照后肾小管上皮细胞线粒体呈现肿胀、基质变薄、电子密度减低、嵴断裂、数量减少与排列紊乱等变化。     

~(12)C离子辐射对人淋巴细胞端粒长度的影响

目的探讨12C离子辐射对人淋巴细胞端粒长度的影响。方法培养人淋巴细胞Peng-EBV接受12C离子束照射,剂量率0.3~0.5 Gy/min,照射剂量分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0 Gy。在照射后24、48、72小时收集细胞,提取基因组DNA,采用荧光定量PCR方法检测样本相对端粒长度。结果与对照组相比,照射后48和72小时,各剂量组受照细胞相对端粒长度增加显著。结论12C离子照射可导致培养人淋巴细胞端粒延长,其中1.0 Gy组,照射后24、48、72小时都显著增加,且增加幅度大于0.1、0.5和2.0 Gy组的受照细胞。     

在DNA损伤修复信号传导通路中ATM介导的BCA1及RAD51作用机理的研究

为阐明毛细血管扩张性共济失调突变基因(Ataxia telangiectasia mutated,ATM)介导的乳癌基因1(Breast cancer gene 1,Brca1)磷酸化及其下游DNA修复相关蛋白(DNA damage repair protein 51,RAD51)在DNA损伤修复信号传导通路中作用机理,以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(Originated from human skinfibroblast GM Cell,GM0639)为对照,用免疫共沉淀与Western blot方法,观察60Co γ射线照射后共济失调症(Ataxia telangiectasia,AT)细胞、ATM转染的AT细胞(ATM+-AT)和GM细胞的BRCA1及RAD51蛋白表达的变化.经0、5、10、20Gy辐照后,AT细胞通过免疫共沉淀及Western Blot法分析其中ATM和BRCA1蛋白以及BRCA1和RAD51蛋白之间的相互作用以及PI3K抑制剂对ATM磷酸化其下游基因的影响.0Gy照射ATM+-AT和GM细胞未出现BRCA1表达条带;照射后,GM细胞、ATM细胞BRCA1和RAD51蛋白均有表达,而AT细胞无表达;PI3K抑制剂Wortmannin对经电离辐射照射后的AT、ATM+-AT和GM细胞中BRCA1蛋白表达具有抑制作用;照射后ATM+-AT和GM细胞中BRCA1和RAD51蛋白均有表达.因此,电离辐射照射后,BRCA1由ATM介导磷酸化后可进一步与RAD51相互作用,这是信号通路传导过程中的一个级联反映,从而修复损伤的DNA,保持基因组的稳定性.     

电离辐射对MC3T3细胞增殖和Notch1、Jagged1基因表达的影响

揭示了电离辐射对成骨细胞系MC3T3细胞的增殖及其对Notch1和Jagged1基因表达的影响.成骨细胞系MC3T3细胞,经过0、2和4Gy 137Cs γ射线照射,运用MTT、实时定量PCR技术,检测电离辐射对与MC3T3细胞的增殖和增殖分化相关基因Notch1和Jagged1表达的影响.照射剂量为2和4 Gy时,细...     

自吞噬促进电离辐射之后细胞的存活

为探讨p53调控的自吞噬在电离辐射诱导的DNA损伤中的作用,采用慢病毒法构建p53敲低及对照细胞系,用血清饥饿诱导自吞噬,3-MA抑制自吞噬,再用γ射线照射细胞。结果发现,p53抑制自吞噬效应蛋白p62/SQSTM1的转录激活,且激活自吞噬可以促进电离辐射之后细胞的存活,说明自吞噬在电离辐射之后的细胞命运决定中起着关键作用。进一步的研究发现,抑制自吞噬可以抑制电离辐射诱导的细胞周期阻滞,从而揭示了DNA损伤诱导G2/M周期阻滞及自吞噬诱导细胞存活之间的联系,为研究基于自吞噬通路的新型辐射增敏及抗辐射药物提供了新思路。     

褪黑素对小鼠脾淋巴细胞电离辐射损伤的防护作用

本文旨在探讨体内补充褪黑素 (melatonin ,MLT)对电离辐射所致小鼠脾淋巴细胞损伤的影响及其机制。实验采用昆明小鼠 ,连续 1周每天腹腔注射 0 .1mg/kg(体重 )的MLT ,第 8天给予 1～ 4Gy全身照射 ,2 4h后检测脾淋巴细胞数量的变化。另外 ,小鼠腹腔单次注射 0～ 2 .5mg/kg(体重 )的MLT ,60min后给予 2GyX射线全身照射 ,1 2h后检测脾淋巴细胞凋亡及细胞周期时相 (用流式细胞术 )和DNA裂解率 (用荧光分光光度法 )的变化。结果发现 :小鼠连续 1周腹腔注射MLT ,1 .0～ 4.0Gy照射后 2 4h ,脾淋巴细胞数呈剂量依赖性降低 (p <0 .0 1 ) ;而受照前连续 1周注射MLT( 0 .1mg·kg- 1·d- 1) ,预先给予MLT组脾淋巴细胞数比预先不给予MLT组显著增高 (p <0 .0 5 )。 2GyX射线全身照射后 1 2h ,细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率与对照组相比显著升高 (p <0 .0 1 ) ,G0 /G1期和G2 +M期细胞百分数增高 (p <0 0 5 ) ,S期细胞百分数降低 (p <0 .0 1 ) ,细胞发生G1和G2 期阻滞 ;而照射前单次注射MLT ,其凋亡小体百分率和DNA裂解率均显著降低 (p<0 .0 5或p <0 .0 1 ) ,G1期阻滞缓解 ,G2 期阻滞加剧。以上结果表明照射前预先补充MLT可减轻电离辐射所致小鼠脾淋巴细胞损伤 ,对小鼠免疫功能具有保护作用