人呼吸道合胞病毒的稳定性

目的观察人呼吸道合胞病毒(HRSV)在不同温度保存、冻融和超声波处理的稳定性。方法将HRSVA2株接种于KMB17细胞上适应培养后,收获病毒液,分别置于37、22、4和-20℃条件下保存不同时间,或经冻融和超声波处理后,用微量细胞病变法检测HRSV的感染性滴度,观察其稳定性。结果HRSV在37℃保存,病毒感染性滴度下降很快,第4天时,降至约1.50lgCCID50/ml,5d后降至1.00lgCCID50/ml以下,几乎检测不到;在22℃保存,病毒感染性滴度下降相对缓慢,第14天时比原始滴度降低约3.20lgCCID50/ml;在4℃和-20℃下保存较稳定,分别保存5周和3个月后,病毒感染性滴度下降<0.60lgCCID50/ml。冻融1、2、3次,病毒感染性滴度分别下降1.37、2.55和3.61lgCCID50/ml,冻融4次后,病毒几乎无感染性。超声波处理后,病毒感染性滴度下降很快,处理1次病毒滴度即下降至原始滴度的50%左右,处理2次后,病毒几乎无感染性。结论HRSV不宜在37℃和22℃存放,可短暂保存于4℃,在-20℃可保存较长时间;冻融和超声波处理均对病毒感染性滴度有明显影响。     

轮状病毒P[8]G1株在KMB17细胞上的适应性及其免疫原性

目的研究轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应性及其免疫原性。方法将人轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在KMB17细胞上进行适应培养,连续传代10代,免疫荧光法检测病毒的增殖情况,免疫胶体金法检测病毒的抗原性,微量滴定法检测病毒的感染性滴度,并进行病毒基因组稳定性及免疫原性检测。结果轮状病毒Wa株在KMB17细胞上连续传代后,细胞病变逐渐增快;抗原性逐渐增强;至第10代达增殖高峰,病毒滴度达4.25CCID50/ml;在传代过程中,病毒基因组核酸带型保持一致;经皮下和口服2种途径免疫小鼠,血清抗体效价均达1:8192。结论轮状病毒Wa株可在KMB17细胞上稳定增殖,病毒保持了毒株的基本生物学特性,且具有较好的免疫原性。     

感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响

目的观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响。方法分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果病毒感染Vero细胞后48h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达莞。Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)lgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)lgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现在接种后48～96h,3组MOI病毒最高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)lgCCID50/ml。结论不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MO(I0.001)制备疫苗。     

Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的适应性及其生物学特性

目的研究Ⅳ型登革病毒中国株LD34在人胚肺二倍体细胞KMB17上的传代适应性及其生物学特性。方法将Ⅳ型登革病毒中国株LD34在C6/36细胞上扩增,并采用微量细胞病变法测定病毒的感染性滴度。以2.0 MOI的病毒接种KMB17细胞传代培养,筛选KMB17细胞适应株,并进行培养条件的优化。将Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株连续传10代,测定病毒的感染性滴度,免疫荧光法检测病毒的抗原性,RT-PCR法扩增登革病毒的特异性基因。结果筛选出的Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的最佳培养条件为病毒接种MOI 0.4,培养基血清浓度5%;其感染KMB17细胞后可产生明显的细胞病变(CPE),连续传10代,病毒滴度达7.75 CCID50/ml;第10代病毒的抗原性呈阳性;第10代病毒能扩增出511 bp的登革病毒特异性基因和393 bp的Ⅳ型登革病毒特异性基因。结论获得了Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株,病毒保持了原始毒株的基本生物学特性,且具有较好的抗原性。     

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。     

悬浮Vero细胞快速扩增轮状病毒

目的探讨在悬浮Vero细胞中快速扩增轮状病毒(RV)的方法。方法 Vero细胞经消化后,直接接种KMG1b7株RV。采用微量滴定法、PAGE和RT-PCR等方法比较悬浮扩增、静置培养及微载体发酵培养RV的感染性滴度、基因组核酸带型和型特异VP7基因序列;采用电镜观察和Westernblot鉴定悬浮扩增RV的形态及结构蛋白的抗原性。结果悬浮细胞扩增的RV接种24h后病毒感染性滴度达峰值,为6.00lgCCID50/ml;而静置培养和微载体发酵培养分别在接种后(96±24)h和(48±6)h达峰值,分别为(6.00±0.25)lgCCID50/ml和(6.50±0.25)lgCCID50/ml。悬浮扩增的RV基因组呈典型的4-2-3-2G1血清型带型,G1型特异基因VP7序列未发生突变。悬浮扩增的RV形态和结构蛋白的抗原性未发生改变。结论在悬浮Vero细胞中扩增RV可以缩短病毒制备周期,提高病毒收获量,有利于RV疫苗的研制或生产。     

Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化;免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态。结果在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID50/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因;病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常。结论成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性。     

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性

目的探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性。方法轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上。用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测。结果经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱。通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖。以0.05MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96h。连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定。结论轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖。     

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMBl7上的适应性

目的 探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性.方法 轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上.用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测.结果 经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱.通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖.以0.05 MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96 h.连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定.结论 轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖.     

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。     

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒

目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。     

Sabin1型脊髓灰质炎病毒在人二倍体细胞适应过程中5′端非编码区序列变异与滴度的关系

目的　探索Sabin 1型脊髓灰质炎病毒在人胚肺二倍体细胞适应过程中 5′端非编码区序列变异及其与病毒感染性滴度的关系。方法　将Sabin 1型脊髓灰质炎病毒疫苗株在人胚肺二倍体细胞KMB17中连续传 11代 ,检测连续传代后感染性滴度 ,并检测 11个代次 5′端非编码区序列。结果　随着传代次数的增加 ,感染性滴度逐渐升高 ,在第 7代达到最高 ,为8 12 5LgTCID50 ml。在传代过程中 ,从第 3代起 5′端非编码区 74 2个核苷酸只出现 1个位点发生变异 ,第 6 39位由A变为G。结论　Sabin 1型脊髓灰质炎病毒经KMB17细胞传 11代 ,已适应KMB17细胞。Poliovirus 5′端非编码区与毒力直接相关的第4 80位核苷酸未发生回复突变。