A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的非临床安全性评价

目的分析注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素活性药用成分(active pharmaceutical ingredient,API)的纯度、N-末端氨基酸序列和相对分子质量,并通过多个非临床研究试验,评价两种制品在药理、毒理特性等方面的一致性。方法采用SDS-PAGE法检测注射用A型肉毒毒素(衡力~,Lantox~,以下简称复合物)和注射用A型肉毒神经毒素(Chintox~,以下简称神经毒素)的纯度;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列比对,确证其各组分的成分;毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)检测其在非还原及还原条件下各组分的相对分子质量;单次肌肉注射、静脉注射、灌胃给予大鼠及单次肌肉注射给予食蟹猴的试验评价复合物和神经毒素的急性毒性;重复肌肉注射给予食蟹猴39周和恢复期12周的药理毒理试验评价复合物和神经毒素的长期毒性;家兔红细胞的体外溶血试验评价两者的溶血性;肌肉注射给予大鼠Ⅰ、Ⅱ段生殖毒性试验评价肉毒毒素的生殖毒性。结果神经毒素组:非还原条件下,神经毒素相对分子质量约152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约101 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约51 000、N-末端氨基酸序列PFVNKQFNYK的轻链组成;复合物组:非还原条件下,含A型肉毒神经毒素(Mr 152 000)、非毒素非血凝素蛋白(non-toxic non-HA,NTNH)(Mr 136 000)、HA70组分(Mr 57 000、17 000)、HA33组分(Mr 30 000、28 000)和HA17组分(Mr 15 000),还原条件下,则含有重链、轻链、NTNH、HA70、HA33和HA17组分。注射用A型肉毒毒素、注射用A型肉毒神经毒素单次肌肉注射和静脉注射给予大鼠,肌肉注射的最大耐受剂量≥100 U/kg,静脉注射的最大耐受剂量≥30 U/kg;单次肌肉注射给予食蟹猴所产生的急性中毒反应与死亡情况一致,最大耐受剂量均为20 U/kg,近似致死剂量为40 U/kg;反复肌肉注射给予食蟹猴的试验中,未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)均为16 U/kg;在体外对家兔红细胞无溶血作用,不引起红细胞凝聚;Ⅰ段生殖毒性试验对雄鼠生育力的NOAEL为4U/kg,对雌鼠生育力的NOAEL为8 U/kg,对孕鼠早期胚胎发育的NOAEL为16 U/kg;Ⅱ段生殖毒性试验对孕鼠的NOAEL为1 U/kg,对胚胎-胎仔毒性和致畸性的NOAEL为16 U/kg。结论注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素在食蟹猴和大鼠的急性毒性、长期毒性等试验中,剂量、动物病理解剖结果一致,进一步说明A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的药理毒理特性是相同的,且在反复肌肉注射给予食蟹猴的长期毒性试验中发现,A型肉毒神经毒素更不易产生抗体。在神经毒素灌胃试验中半数致死剂量高于复合物,表明其安全性更好。     

肉毒神经毒素体外检测方法的研究进展

肉毒神经毒素的体外检测对于食品卫生、进出口检疫检验、临床诊断以及应对生物恐怖袭击是非常重要的。本文就肉毒神经毒素体外检测方法的研究进展作一综述。     

治疗用A型肉毒梭菌神经毒素全基因克隆及序列分析

目的对我国治疗用A型肉毒毒素生产用菌株Hall株神经毒素(BoNT)全基因进行克隆及序列分析,了解其遗传特性,为该制剂的质量控制提供依据。方法取生产用主代种子、工作种子,通过PCR扩增BoNT全基因片段,将其克隆至载体pGEM-T中,构建重组克隆质粒pGEM-T-BoNT,对克隆的BoNT基因进行序列测定与分析。结果测得的Hall株BoNT全基因序列3891bp,共编码1297个氨基酸。4种核苷酸的比例分别为:A:40.58%,G:16.17%,T:33.13%,C:10.13%;GC含量为26.29%,AT含量为73.71%。主代种子、工作种子核苷酸序列3591位的G变成A,为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变。序列测定结果与GenBank中登录的Hall标准株进行比较,主代种子、工作种子核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.99%和100%。结论 A型肉毒梭菌Hall株在实验室长期的保存和生产传代过程中,BoNT基因遗传特性非常稳定。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

B型肉毒神经毒素的纯化及胰蛋白酶对其作用分析

目的纯化B型肉毒神经毒素,并比较未激活和用胰蛋白酶激活的B型肉毒神经毒素的分子特性,分析在酸性和碱性条件下B型肉毒毒素复合物的完整性。方法取未激活、胰蛋白酶激活和热处理激活的B型肉毒毒素复合物,采用阴离子交换柱层析纯化神经毒素(分别为A、B和C组)。在酸性条件下溶解激活的B型肉毒毒素复合物(D组)。对各组进行纯度(特异毒性)测定和SDS-PAGE分析。结果柱层析后,神经毒素纯度均比复合物的纯度高,激活的神经毒素比未激活的高2～3倍;在非还原和还原条件下,A组的SDS-PAGE显示神经毒素、重链和轻链3条带;B组显示重链和轻链2条带;C组在非还原条件下显示重链和轻链2条带,在还原条件下只显示轻链1条带。在酸性条件下,B型肉毒毒素复合物由神经毒素与非毒性成分构成,在碱性条件下,神经毒素与非毒性成分分离。结论已成功纯化了B型肉毒神经毒素,经胰蛋白酶处理后,单链裂解为双链,比活性提高。     

注射用A型肉毒毒素的生物学特性及质量分析

目的对注射用A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A for injection,商品名衡力,出口商品名BTXA)制品中的活性药用成分(Active pharmaceutical ingredient,API)的性质及2009～2011年生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性进行分析。方法对BTXA收获物样品进行阴离子交换层析,分离毒素复合体各组分;采用血凝试验、HPLC法、SDS-PAGE、等点聚焦电泳及N-末端氨基酸测序等方法分析A型肉毒毒素复合体及其各组分的性质;统计2009～2011年连续生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性数据,分析连续生产的工艺稳定性和质量重现性。结果 BTXA收获物样品在碱性条件下可被解离,解离出的A型肉毒神经毒素相对分子质量约为150 000,无血凝效价;BTXA的API为完整的单体,纯度均在99.5%以上;复合物和神经毒素的等电点分别为4.97、4.91,N-末端氨基酸测序结果与GenBank基本一致;在连续3年的生产过程中,原液比活性平均为3.0×107LD50/mg蛋白,BTXA成品中API载量约为5 ng/瓶。结论注射用A型肉毒毒素的活性成分是特异的复合体结构,可在碱性条件下解离出A型肉毒神经毒素;BTXA原液的比活性在连续3年的生产中持续稳定,具备很好的连续性,为临床使用的安全性提供依据。     

A型肉毒毒素轻链蛋白的表达及纯化

目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE3),分别于37、30、25℃IPTG诱导表达,表达产物经Chelating Sepharose 4Fast Flow(Cu~(2+))层析柱纯化,纯化产物经尿素梯度复性。结果质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL经酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,主要以包涵体形式存在,37℃诱导表达量最高,占菌体沉淀总蛋白的41%;包涵体经2%Trition-X100和2 mol/L尿素洗涤后,可去除部分杂蛋白,8 mol/L尿素能溶解大部分包涵体;经再次浓缩后,蛋白浓度可达89μg/ml,纯度达90%。结论成功克隆及表达了Bo NT/A轻链基因,为制备抗Bo NT/A轻链单链抗体以及研究肉毒中毒机制和治疗方案奠定了基础。     

肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展

肉毒毒素生物学活性的检测和肉毒中毒诊断方法的研究进展迅速,对食品检验、肉毒中毒实验室诊断、生物反恐和肉毒毒素制品的开发及应用具有十分重要的意义。本文就肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展作一综述。     

重组蓖麻毒素A链的表达及半乳糖修饰

目的表达重组蓖麻毒素A链(ricin toxin A,RTA),并进行半乳糖糖基化修饰。方法将重组质粒pET-28a-RTA转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白RTA,通过镍离子亲和层析柱纯化包涵体,并复性。采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]/N,N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)法对重组RTA进行半乳糖糖基化修饰,并对偶联反应温度(20、25、30和37℃)和半乳糖与RTA的投料比(100∶1、500∶1、1 000∶1、1 500∶1和2 000∶1)进行优化。结果 RTA蛋白相对分子质量约34 000,主要以包涵体形式表达,纯化复性后纯度大于90%。最适偶联反应温度为25℃,半乳糖与RTA最适投料比为1 000∶1。结论成功表达了RTA蛋白,并通过EDC/NHS法实现了半乳糖与RTA的偶联。     

A、B、E、F型肉毒抗毒素的制备与检定

目的　制备马抗肉毒 (Botulinum)A、B、E、F型抗毒素。方法　菌种经过复苏分离与检定后 ,采用产毒培养、酸沉、盐析及脱毒等步骤 ,制备肉毒A、B、E、F四型类毒素 (Toxoid)和试验毒素 (Testtoxin) ,免疫健康马匹。结果　各型血浆效价均超过 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》中对于抗毒素的要求 ,B型与F型的效价均超过 2倍以上 ,A型与E型也达到较好的应答水平。结论　已成功制备四型肉毒抗毒素。     

艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段的表达及纯化

目的表达并纯化艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段,为制备高效防治艰难梭菌感染的疫苗和诊断抗原奠定基础。方法提取艰难梭菌染色体基因组DNA,用PCR扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达产物经金属螯合层析纯化,用SDS-PAGE进行分析。结果已成功地克隆了艰难梭菌细胞毒素B羧基末端重复区域的1848bp的基因,经双酶切、PCR和测序鉴定,插入到载体的基因与GenBank中公布的艰难梭菌VPI10463ToxinB3基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的相对分子质量为71300,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,可溶性表达占上清的14%,包涵体占沉淀的82·7%,纯化后可溶性蛋白浓度为0·781mg/ml。结论所构建的含艰难梭菌ToxinB3基因的pET22b(+)CDB3重组质粒能高效表达目的基因。金属螯合层析纯化重组蛋白CDB3的方法简便,特异性好。     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

破伤风毒素C片段的基因克隆、重组表达及免疫原性

应用PCR技术直接从破伤风芽孢杆菌质粒DNA中扩增出 1 4Kd的破伤风毒素C片段基因 ,经DNA序列测定证明其为破伤风片段C基因。将此基因克隆入大肠杆菌谷胱甘肽 S 巯基转移酶融合表达载体pGEX 4T 2 ,构建成重组表达质粒pGEX TC。经SDS PAGE蛋白电泳鉴定 ,表达产物为 76Kd的特异性重组蛋白。免疫印迹实验证实 ,重组蛋白抗原是破伤风C片段抗原。动物实验证明此重组抗原具有良好的免疫原性 ,1μg免疫剂量可使动物产生 1～ 2IU/ml的破伤风抗毒素 ,ELISA抗体滴度可达 1∶80 0。     

血栓调节蛋白核心片段的基因克隆、表达及鉴定

目的 获得血栓调节蛋白及其核心片段,以便研制临床诊断治疗制品。方法 应用ＰＣＲ获得血栓 调节蛋白ＥＧＦ４～６的基因片段,构建克隆载体ＥＧＦ４－６／ＰＹ和表达载体ＥＧＦ４－６／ＰＢＶ２２０）,表达血栓调节蛋白ＥＧＦ４-６。结果 原核细胞表达量约占菌体可溶性蛋白的１２％,经ＫＰＴＴ试剂盘检测具有生物学活性。结论 为进一步 研究临床诊断治疗制剂创造了条件。     

抗人ICAM-1单链抗体表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单链抗体(ScFv)的表达载体,并在大肠肝菌中表达。方法从分泌ICAM-1单抗的杂交瘤细胞中提取RNA,用RT-PCR扩增抗体VH和VL基因,重叠延伸PCR扩增人ICAM-1-ScFv基因,将其连接到pET-22b(+)载体上,转化大肠杆菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,表达产物纯化及复性后,检测特异性及活性。结果序列分析表明抗ICAM-1 ScFv基因全长为744bp,编码247个氨基酸,其中含357bp的VH基因片段和342bp的VL基因片段。表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的32%。经变性和复性后,纯度达80%以上,复性率达25%。Western blot和ELISA检测,ScFv均可与ICAM-1抗原特异性结合。细胞黏附试验表明ScFv能抑制ICAM-1与HSB2细胞间的黏附,其作用稍弱于亲本mAb。结论已成功构建了抗人ICAM-1的ScFv表达载体,其表达产物具有抗体特异性和活性。     

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp)TpN47(68~410 aa)重组蛋白。方法采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47(202~1230 bp)片段,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47,经酶切鉴定后转化EcoliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,Western blot鉴定其免疫反应性。结果PCR法扩增出约1 000 bp的目的片段,原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47经酶切鉴定正确,表达的蛋白约占菌体总蛋白的43%,相对分子质量约为39 000,以包涵体形式存在。经纯化后蛋白纯度达95%以上,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础。     

亚微米重质碳酸钙表面改性及填充聚丙烯塑料研究

采用实验室合成的三种改性剂对亚微米重质碳酸钙进行表面改性。并采用TEM、粒径分析、IR、Zeta电位测定、SEM等几种分析测试方法,对亚微米重质碳酸钙及其填充PP塑料进行了表征。结果表明,经改性的亚微米重质碳酸钙粒度减小,比表面积增大,改性剂在碳酸钙的表面形成了化学吸附。经不同改性剂改性的碳酸钙的Zeta电位不同。提高了重钙粉体作为填料的功能性。     

人破骨细胞形成抑制因子活性域片段在大肠杆菌中的融合表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesisinhibitoryfactor,OCIF)活性域片段。方法　从中国人正常肝细胞系LO2中提取总RNA ,利用RT PCR得到OCIF活性域编码基因cDNA ,将其与pMD18 T连接 ,转化大肠杆菌K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18 OCIFAD ,经双酶切得到OCIF活性域编码片段 ,将其插入pMAL c2载体中 ,转化大肠杆菌TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果　所获得的OCIF活性结构域编码序列片段经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS PAGE分析可见在相对分子质量 6 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Westernblot证实了表达产物能与抗人OCIF单抗发生特异性反应。结论　已成功地获得了人OCIF活性结构域编码片段的克隆 ,并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。表达产物对体外培养破骨细胞的骨吸收功能有明显的抑制作用。