转mtlD/gutD双价基因稻米对小鼠的毒性试验

对转mtlD/gutD双价基因稻米进行了小鼠急性亚急性毒性实验、致突变试验和 30天喂养试验。结果表明 :小鼠经口LD50 >30g/kg体重 ,无致突变作用 ,30天喂养试验 18g/kg、36g/kg、5 4g/kg体重各剂量组小鼠发育、增重、食物利用率、血常规、脏体比及病理组织学观察等各项指标与基础对照组比均无显著性差异 ,无作用剂量为 5 4g/kg体重。表明转mtlD/gutD双价基因稻米对小鼠没有毒性 ,属安全食品     

半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草研究

用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种子和烟苗进行初步筛选鉴定,再用Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基因烟苗中外源转几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式PCR(Semi-nested PCR)检测转几丁质酶基因烟草植株及其烤后烟叶中的所转目的基因;利用限制性内切酶Hind Ⅲ对半嵌套式PCR产物进行酶切,从而验证半嵌套式PCR产物是否为真正的目的基因。研究结果表明,半嵌套式PCR是一种快速、灵敏的检测转几丁质酶基因烟草植株及烤后烟叶的方法。      

转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果保鲜中的应用

通过对β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的抑菌性质进行分析,综述了β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在果蔬方面的抗病害研究进展,对β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果采后保鲜中的作用进行了展望.     

几丁质酶基因在烟草栽培品种中的表达

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）对来源于一种生物杀虫剂（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）的几丁质酶基因进行体外扩增，并插入载体质粒ｐＲＯＫ２中，然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ。用重组质粒ｐＲＯＫ２ＤＮＡ转化植物转基因载体——土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株。借助于土壤农杆菌侵染烟草叶圆片，将目的基因导入。通过组织培养诱导生芽和生根，获得烟草再生植株。利用含卡那霉素的培养基对再生烟株进行初步筛选。进一步ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果表明：转基因烟草中有几丁质酶基因和蛋白的表达。初步检测结果表明：转基因烟草具有较高的几丁质酶活性。     

链格孢菌侵染采后甜瓜果实组织几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表达分析

以伽师瓜（抗病性强）和86-1甜瓜（抗病性一般）果实为实验材料,研究链格孢菌（Alternaria alternata）侵染后几丁质酶（chitinase,CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase,GLU）基因表达规律。甜瓜果实接种A. alternata,7?℃贮藏,测定病斑大小,荧光定量聚合酶链式反应测定CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量。结果表明：伽师瓜和86-1甜瓜接种A.?alternata,在侵染9?d时出现病斑,9～24?d病斑直径不断扩大,86-1甜瓜病斑直径大于伽师瓜,侵染24?d时86-1甜瓜病斑直径是伽师瓜的1.12?倍,伽师瓜对A.?alternata侵染的抵抗能力要强于86-1甜瓜。在侵染期间,伽师瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量显著提高,呈先升高后降低的变化趋势,伽师瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量最高峰出现时间分别相差3、6、3?d,伽师瓜CmCht1、CmCht2相对表达量始终高于86-1甜瓜,CmGlu相对表达量在侵染12～24?d高于86-1甜瓜。在侵染期间CmCht1、CmCht2和CmGlu表达规律存在差异,侵染前期CmCht1、CmCht2相对表达量较高,侵染中期和后期CmGlu相对表达量较高;A.?alternata侵染前期主要诱导了CHT基因的表达,中期和后期主要诱导了GLU的基因表达,CHT和GLU的基因协同表达,起到抗病性的作用。伽师瓜抗病性强于86-1甜瓜与CHT和GLU的基因的表达密切相关。     

细菌几丁质酶基因转化烟草的研究

为了提高烤烟品种K 32 6对真菌病害的抗性 ,以烟草再生植株的叶片为受体 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,经PCR检测 ,初步证明了细菌几丁质酶基因已整合到烟草的基因组中 ;同时研究了再生烟草叶片的耐卡那霉素水平、受体预培养对转化的影响以及促进转化植株的生根等。结果表明 :培养基中卡那霉素浓度为 5 0mg/L时 ,能完全抑制烟草叶片的再生 ;烟草叶片预培养 2d的转化率提高 ;添加 0 .2mg/LIAA(吲哚乙酸 )能显著地提高转化植株芽梢的生根率。     

聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取α-葡聚糖酶

采用聚乙二醇-硫酸铵(PEG-(NH4)2SO4)双水相体系对α-葡聚糖酶进行萃取,以两相比、酶活、蛋白浓度、比活力以及萃取率为参数进行比较,探讨了使用不同分子量的PEG、不同的PEG浓度以及不同(NH4)2SO4浓度下对酶分配行为的影响。实验结果表明,α-葡聚糖酶在质量分数13%的PEG4000以及13%的(NH4)2SO4的双水相系统中,可获得较高的比活力2364.97 U/mg以及萃取率99.94%。     

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果保鲜中的应用

通过对β-1,3葡-聚糖酶和几丁质酶的抑菌性质进行分析,综述了β-1,3葡-聚糖酶和几丁质酶在果蔬方面的抗病害研究进展,对β-1,3葡-聚糖酶和几丁质酶在热带水果采后保鲜中的作用进行了展望。      

转Bt基因水稻的食用安全性评价研究进展

水稻（Oryza sativa）是我国重要的经济作物,其优化育种一直是研究的重点。苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt）抗虫基因的出现,开辟了利用外源基因培育转基因抗虫作物的新领域。目前,转基因抗虫水稻的培育技术已日趋成熟,而其对人体的潜在安全性问题却备受争议。转Bt基因水稻能否实现商业化是人们关注的焦点。本文就转Bt基因水稻的食用安全性评价的研究进展进行综述,以期为我国转Bt基因水稻的风险评估和推广提供一些参考。     

转cry2A*基因大米T2A-1慢性毒性试验研究

目的通过掺入饲料的方式连续给予SD大鼠转cry2A~*基因大米T2A-1 52周,为其食用安全性提供基础毒理学数据。方法 144只无特定病原体(SPF级)SD大鼠按体质量随机分为三个组,每组雌雄各半。根据大米营养成分测定结果,将T2A-1大米及其亲本明恢63大米均按最大比例掺入饲料中,成长期和维持期分别为60.75%、66.75%,同时设置AIN-93配方饲料组作为营养对照。连续喂饲52周;试验期间观察并记录一般状况、体质量、摄食量等,并开展血液、血生化、尿液常规检测;试验结束时处死动物进行病理学检查等。结果转基因和亲本大米的主要营养成分含量相近。52周试验周期中,各组大鼠一般状况均良好,死亡率和肿瘤发生率组间差异无统计学意义(P0.05)。与非转基因组比较,转基因组大鼠体质量、进食量、食物利用率差异无统计学意义(P0.05);血液、血生化、尿液检测未发现有毒理学意义的改变;各组组织病理学检查均未发现有意义的病理学改变。结论在本试验条件下,转cry2A~*基因大米连续喂饲SD大鼠52周,未发现其对实验动物产生不良的影响。     

β-葡聚糖酶降解黑木耳多糖工艺研究

为降低黑木耳多糖的分子量,提高黑木耳多糖的利用率,采用β-葡聚糖酶对黑木耳多糖进行酶解试验.在单因素试验基础上,采用正交试验确定最佳酶解工艺条件,得出4种因素对β-葡聚糖酶的活力影响顺序:加酶量>酶解pH值>酶解时间>酶解温度,最优工艺条件:加酶量700 U/g、酶解pH5.2、酶解时间2 h、酶解温度30℃,在该条件...     

多重PCR法检测转Bar、Bt基因双抗稻米

旨在建立一种快速、有效的检测转基因双抗稻米的方法,以转Bar、Bt基因双抗稻米为原料,针对其水稻内源基因SPS和外源基因(包括Bar基因、Bt基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子和NOS终止子)设计多重PCR检测体系。结果表明,应用该多重PCR检测体系可快速检测出原料中的全部6条目标基因,检测灵敏度可达0.9%。     

微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质和基因工程研究进展

对微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质,基因克隆和表达等方面研究进展作了综述.     

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分,多基因的共表达在各领域有重大的应用价值,本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性,在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因,实现了不相容性共表达,获得了产两种酶的工程菌,酶活力可达1196.8U/mL。比单一酶组分的酶活力高,酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度60℃,在pH5⁷范围内能保持较高活性,酶活可达最高酶活的80%以上,在30⁶0℃范围能有较高的温度稳定性,酶活维持在80%以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。      

热纤梭菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取热纤梭菌(Clostridium.sp)基因组DNA,首次通过PCR克隆了该菌的β-葡聚糖酶基因全长。结果表明:该基因全长1040bp,ORF为1003bp,编码334个氨基酸,计算分子质量为37.8kD,等电点为7.67。经Blast分析,该序列与热纤梭菌同源性最高(99%),而与基因库中嗜热梭菌的同源性为94%,该基因已被GenBank接受(AY225318)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-30a(+)后相连接,构建重组表达载体pET-clo,并导入BL21细菌中表达。酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在37kD左右有表达蛋白带,该工程菌最适酶活29.4U/mL,是出发菌的15倍,最适温度80℃,最适pH9。该工程菌可作为耐热性材料构建耐热性好、酶活高的杂合基因工程菌。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)β-1,3-1,4葡-聚糖酶基因序列,设计特异性引物,以提取的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),将此目的基因克隆至pTG19-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠。序列比较发现,此片段与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacines,M15674)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis,AY365256)分别有99%、95%和94%的同源性。     

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

重组酶聚合酶扩增技术检测转基因水稻中的Cry1Ab/c基因

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术。本研究基于RPA技术建立了转基因水稻Cry1Ab/c基因的检测方法,可在37℃恒温条件下快速检测到转基因水稻中的Cry1Ab/c基因,具有较好的特异性,其绝对及相对检测灵敏度分别达到100个拷贝和0.1%(质量分数),适用于基层实验室及现场快速检测转Cry1Ab/c基因水稻及其制品。     

内切–β–1,4–葡聚糖酶基因在茌梨果实发育及成熟中的表达模式分析

本研究以茌梨(Pyrus bretschneideri Rehd.Cv.Chili)果实为材料,分析了内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGase)基因Pb EG3和Pb EG4在果实发育及成熟衰老时期的表达模式。茌梨果实中Pb EG3和Pb EG4的基因表达量均于发育时期呈现峰值,其中,Pb EG3的基因表达量在花后70 d达到峰值0.31,花后130 d降至0.003;而Pb EG4的基因表达峰值于花后110 d出现,为0.14,花后130 d降为0.005,与EGase的活性变化趋势一致。0℃贮藏期间,茌梨果实中Pb EG3和Pb EG4的基因表达量均呈下降趋势,且二者均在采收点呈现最大值,其中Pb EG3于采后60 d表达量最低,之后表达量略有升高;而Pb EG4在贮藏期间的表达量均较低。采后乙酰水杨酸(ASA)处理能够减少茌梨果实的失重,抑制其可溶性果胶的增加,降低EGase活性,延缓纤维素的降解,从而推迟果实的成熟衰老进程。Pb EG3和Pb EG4可能与茌梨果实的生长发育有关,未参与其采后衰老进程。