牛乳中蜡样芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立一种快速检测牛乳中蜡样芽孢杆菌的荧光定量PCR方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的蜡样芽孢杆菌gyrB基因序列及荧光定量PCR要求,设计合适的特异性引物,提取菌体DNA,对目的基因进行扩增及克隆;以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线;以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。对建立的方法进行特异性及灵敏性验证。结果建立的方法检测其他3种牛乳中常见致病菌(大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌)未见特异性扩增,即无交叉反应;最低检出限为1×10~(-7) ng/μL。以掺入蜡样芽孢杆菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中10. 4 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌,优于国标方法(GB 4789. 14-2014)检测含有相同菌落数的蜡样芽孢杆菌(仅能检测到1. 04×10~2 CFU/mL)。结论建立的方法特异性强,灵敏性高,适用于快速、准确检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌,为实验室快速检测致病菌提供了参考。     

比较分析痰涂片及荧光定量PCR在诊断肺结核中的作用

目的探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法采用痰涂片抗酸染色法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检。结果荧光定量PCR技术的阳性检出率是63.7%(571/897),明显高于抗酸染色法的43.4%(389/897)。2种方法检测对照组的结果均为阴性,特异度为100%(103/103)。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。     

基于微生物学的速食食品致病菌检验研究

分析基于微生物学的速食食品致病菌检验检测结果,总结相应的检验方法.采用传统细菌分离培养法和实时荧光定量PCR法进行检验.对两种检验方法下的致病菌阳性检出情况进行统计,计算出总阳性率.并对两组检验所耗费的时间进行记录,计算出平均用时结果.经统计与组间比较,实时荧光定量PCR法的样本阳性检出率为11.00％,较传统细菌分离...     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

荧光定量PCR与焦磷酸测序联合应用检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌

目的联合运用荧光定量PCR和焦磷酸测序技术快速检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌。方法收集结核病疑似患者痰液样本,提取样本总DNA,运用Taqman荧光定量PCR对结核分枝杆菌的感染进行快速筛查。对检测结果为阳性的样本,采用焦磷酸测序法分别对异烟肼、利福平耐药结核分枝杆菌相关基因katG、rpoB的突变热点进行测序分析,与标准菌株序列比对,判断结核分支杆菌异烟肼、利福平的药敏性。采取Bactec 960药敏法鉴定结核分枝杆菌耐药性,并与焦磷酸测序法药敏检测结果进行比较,评估焦磷酸测序法的可靠性。结果荧光定量PCR技术检测痰液样本结核分枝杆菌的准确率达98.95%,检测时间约3 h;以Bactec 960药敏法鉴定结果为标准,焦磷酸测序法对结核分枝杆菌异烟肼、利福平的药敏鉴定结果准确性分别达93.75%和96.15%,其中,对耐药菌株判断,两种方法的一致性高达98%。结论采用荧光定量PCR检测技术可快速、准确地进行结核分枝杆菌感染筛查,运用焦磷酸测序技术则可快速准确地筛查出耐药样本,从痰液样本采集到结核分枝杆菌感染筛查以及药敏报告发布,全程仅需7 h;耐药菌株的检测可靠性达98%。     

实时荧光定量PCR技术应用研究

实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescent quantitine PCR,FQ-PCR)是在PCR技术的基础上,将荧光基因加入到PCR反应体系中,通过观察荧光基因信号的聚集位置和分布状态,从而监测整个PCR反应过程。是一种具有高度灵敏性和准确性的核酸定量监测技术,它以快捷,准确,定量,高效,便捷方便等特点广泛应用在食品安全,转基因食品检测,病毒细菌RNA,DNA检测,动物学,植物学,昆虫学等多个科研领域。     

一维定量荧光技术在录井过程中的应用

荧光录井技术是随钻过程中快速发现油气显示的重要常规录井手段,荧光光谱技术引入油气勘探领域,在传统试油荧光录井的基础上,定量荧光录井标志着一种新型定量检测油气含量方法的诞生,能够捕捉到肉眼不能发现的石油荧光,弥补了常规荧光录井方法在检测轻质油及凝析油方面的不足,在消减钻井液添加剂影响等方面起到了突出作用。本文以一维定量荧光分析仪测量数据为依据,确定凝析油异常储集层,油基钻井液识别,建立了储集层原油密度解释图版,符合程度较高,能够较好的满足现场及时识别凝析油显示和初步对原油性质的判断。     

多重PCR技术在快速检测中的应用

多重PCR技术是一种将常规PCR扩增体系改进后同时扩增多个目的片段的新型技术。多重PCR凭借高通量、低成本、特异性强的特点,迅速被应用于快速检测领域及科学研究领域。简要概述了多重PCR技术,综述了多重PCR技术在病毒检测、细菌检测、血清学检测的应用,并将其与常规技术进行比较,总结了这些方法的优缺点,为今后多重PCR技术在快速检测中的应用选择提供依据。     

实时荧光定量PCR技术在环境领域研究探讨

实时荧光定量PCR技术实现了核酸的定量,具有灵敏性高,特异性强的特点。本文从实时荧光定量PCR技术的原理,实时荧光定量PCR技术的优点与缺陷,以及荧光定量PCR技术在国内外环境领域的应用情况对荧光定量PCR技术进行探讨,以期使荧光定量PCR技术在环境领域有着更合适的应用。     

双重荧光定量PCR技术在药品微生物检验中的应用

目的建立快速检测金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的双重荧光定量PCR方法并在药品微生物检测中应用。方法通过设计特异性引物和探针,扩增金黄色葡萄球菌的femB基因和铜绿假单胞菌的DNA gyrase subunit B基因,建立荧光定量PCR方法。将该方法应用于30批次药品微生物检测。结果建立同时检测金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2 h。检测灵敏度为50 copies/μL,特异性为100%。30批次样品检验结果表明该方法与传统细菌培养方法结果一致。结论该法缩短了检测时间,具有良好的灵敏性和特异性,在药品微生物检验中有很好的应用前景。     

绿豆源基因的实时荧光定量LAMP检测方法研究

针对绿豆转录间隔区设计一套引物,通过温度优化、特异性和灵敏度试验,建立一种绿豆源DNA的实时荧光定量环介导等温扩增(LAMP)检测方法。结果显示,实时荧光定量LAMP检测方法在温度为61℃时,引物能够将绿豆、大豆、玉米、木薯和马铃薯DNA区分开,灵敏度可以达到0.1pg·uL~(-1)。实时荧光定量LAMP方法能够快速有效地对绿豆源成分进行检测,为绿豆制品真实性检测提供了一种快速准确的检测方法。     

实时定量PCR检测食品中单核细胞增生性李斯特氏菌

单增李斯特氏菌广泛存在于肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等食品中,其中毒严重的可引起血液和脑组织感染。本研究通过实时荧光定量PCR及常规方法对2份单增李斯特氏菌进行能力验证,旨在检验我院检测能力,进而提升我院的综合实力。荧光定量PCR检测单增李斯特氏菌较常规方法更加灵敏、简便和快速!     

利用比色卡黄龙病快速检测试剂盒对柑橘黄龙病的田间检测试验结果初报

黄龙病是柑橘生产上的一种毁灭性病害,由韧皮部限制性细菌Candidatus Liberibacter导致。感染黄龙病的柑橘树的叶片有异常高淀粉积累,因此开发出了基于碘-淀粉显色法的黄龙病快速检测试剂盒。将不同浓度的可溶性淀粉溶液进行碘-淀粉显色反应,制作成快速检测试剂盒配套的比色卡,用来快速确认叶片淀粉值区间。根据不同采样时间的健康树和黄龙病树的叶片淀粉值差异进行统计数据分析,确定了7—10月为黄龙病快速检测试剂盒的适宜采样检测时间。根据显色易辨性和检测准确率将淀粉质量浓度3 000 ppm确定为适宜的黄龙病阳性叶片淀粉值界限,即检测叶片淀粉值≥3 000 ppm判定为黄龙病阳性。通过田间随机取样发现,快速检测试剂盒与实时荧光定量PCR检测方法的一致性约为80%。该黄龙病快速检测试剂盒对田间黄龙病的快速筛查具有重要意义,可作为实时荧光定量PCR检测方法的前序筛查辅助手段。     

荧光光电法检测化妆品中致病菌的研究

建立了一种利用荧光光电技术快速检测化妆品中致病菌的方法。分别对化妆品中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行检测。结果显示此方法检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的特异性良好,检测菌液和人工污染爽肤水及乳液样品的灵敏度均达到100cfu·mL-1,总检测时间可控制在14 h以内。     

反向离子对色谱法同时测定食品纸塑包材中3种荧光增白剂

建立了超声辅助提取-反相离子对高效液相色谱法同时检测纸塑食品包装材料中3种荧光增白剂:荧光增白剂28(CBS)、荧光增白剂85(VBL)、荧光增白剂220(BBU)的方法。利用单因素试验和正交试验确定3种荧光增白剂的提取条件。该方法具有良好的精密度和准确度,符合常规检测要求。根据离子对试剂的作用原理,将四丁基溴化铵水溶液反向离子对作流动相配合使用,使研究对象中的3种荧光增白剂出峰时间大大延迟,并得以有效分离,提高了检测效率。以校园周边超市出售的奶茶、方便面、奶糖、牛奶等纸塑食品包装材为研究对象,对其中的CBS、VBL、BBU等3种荧光增白剂进行测定,结果 10种样品中均检出BBU,未检出CBS,7种样品中检出VBL。     

实时定量PCR分析外周血白细胞的端粒长度

目的采用一种新的简便的测定端粒DNA相对长度的方法-实时荧光定量PCR法,研究其可行性。方法分别取40～49岁和60～69岁的健康男性外周静脉血各12例,提取DNA后,采用实时荧光定量PCR对两组受试者外周血白细胞的端粒长度进行检测。结果40～49岁组的受检者外周血白细胞端粒(1.5±0.87)长于60～69岁组(0.8±0.16)(t=11.37,P<0.05)。结论随着年龄增加健康人外周血白细胞的端粒长度缩短,实时荧光定量PCR测定端粒长度的方法可行。     

食品能力验证中大肠埃希氏菌O157:H7的分离鉴定及质量控制

目的:从能力验证样品中分离、鉴定大肠埃希氏菌O157:H7,提高食源性致病菌的检测能力。方法:本文参照GB4789.36-2016《食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》对2份样品进行检测,对符合VITEK 2 Compact生化鉴定结果的进行血清学鉴定,同时使用荧光定量PCR方法进行联合检验分析。结果:2份能力验证样品均检出大肠埃希氏菌O157:H7,结果均为满意。结论:国标法与荧光定量PCR方法结合进行检测,相互验证,结果可靠性更高,准确性更强。同时在检验过程中应注意培养基、试剂的质量控制,灵活应用目标菌特异性提高检出率等。     

荧光定量PCR方法在脊髓灰质炎病毒突变分析中的应用

目的建立检测脊髓灰质炎病毒突变比例的荧光定量PCR方法,并进行验证及初步应用。方法分别建立检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的荧光定量PCR方法,并进行特异性、重复性和灵敏度验证。通过Ct值计算样品的突变比例(revertant proportion,RP),并进行准确性和重复性验证。采用建立的荧光定量PCR方法检测脊髓灰质炎病毒减毒株的突变比例。结果建立的检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒突变株和非突变株的荧光定量PCR方法能够特异性扩增相应基因片段;重复性试验Ct值的变异系数(CV)为0.085%~5.564%;灵敏度为1×10-7~1×10-6ng,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型非突变荧光定量PCR可分别检测到含量约0.084 3、0.029 2和0.266 7 CCID50的病毒。荧光定量PCR测定RP的方法经验证发现,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合质粒对照的RP检测值与理论值的差异较小,分别为0.040 9±0.037 4、0.008 8±0.034 3和-0.029 6±0.026 8。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎减毒株的RP分别为0.001 0、0.002 0和0.001 7。结论荧光定量PCR分析脊髓灰质炎病毒突变比例的方法,特异性、重复性及准确性均较好,并具有较高的灵敏度,可用于实验室内部对脊髓灰质炎病毒的突变比例测定,并可能成为脊髓灰质炎病毒体内或体外神经毒力评价的替代方法。     

适配体功能化纳米材料传感器快速检测食源性致病菌

食源性致病菌可以引起的严重的食品安全问题。传统方法检测食源性致病菌存在一系列的问题(复杂、耗时、高成本等)。基于适配体修饰纳米材料传感器有望替代传统的检测方法,实现对食源性致病菌实时、快速、灵敏检测。本文简要介绍基于适配体纳米金比色传感器和基于适配体二硫化钼纳米片荧光传感器用于食源性致病菌的检测方法,并且介绍两种方法的局限性。最后,对适配体修饰纳米材料传感器的发展趋势和应用前景提出展望。     

大肠埃希氏菌荧光定量PCR法与酶底物法相关性分析

针对大肠埃希氏菌国标法中的酶底物法检测时间长的现状,使用荧光定量PCR法和酶底物法同步检测大肠埃希氏菌,并比较分析两种方法检测结果的相关性.结果表明:荧光定量PCR法能检出细菌数为50 CFU/(100 mL)及以上的样品,含量在50～2000 CFU/(100 mL)的大肠埃希氏菌与酶底物法相比具有较高的一致性,相关系数r=0.99,经t检验分析,两种方法的检测结果无差异.荧光定量PCR法具有操作简便和检测时间短的优势,能作为酶底物法的有效补充手段,在实际水样的应急检测中具有较强的应用价值.