广东省水生动物中的维氏气单胞菌和无乳链球菌的耐药性评估

为研究广东省水生动物中的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)对不同种类抗生素的药物敏感性,从广东省9个地区人工养殖的水生动物体内分离维氏气单胞菌及无乳链球菌。其中分离出32株维氏气单胞菌和16株无乳链球菌。利用药敏纸片法检测分离菌株对14种抗生素的药物感受性,发现两种病菌对其中的7种抗菌药物有明显的敏感性。利用最小抑菌浓度法检测分离菌株对7种敏感抗生素的耐药性,发现32株维氏气单胞菌对甲砜霉素(29%)部分耐药,盐酸土霉素(41%)和交沙霉素(38%)部分敏感,对盐酸环丙沙星(82%)、强力霉素(82%)、氟苯尼考(75%)和磺胺二甲嘧啶(100%)都敏感。16株链球菌对甲砜霉素(100%)全部耐药,对交沙霉素(25%)部分敏感,对盐酸环丙沙星(100%)、强力霉素(100%)、盐酸土霉素(100%)、氟苯尼考(100%)和磺胺二甲嘧啶(88%)都敏感。本论文的研究可以对今后抗生素在维氏气单胞菌与无乳链球菌的使用中提供一定的参考,促进抗生素的合理使用。     

乳酸菌基因敲除技术的研究进展

乳酸菌是革兰氏阳性菌,广泛用于食品、医药、轻工业及饲料工业等行业。对乳酸菌进行遗传操作是调节、优化其代谢途径的基础。通过基因敲除技术改造乳酸菌基因组,可以判断基因组中未知基因所编码产物的功能,有目的、有选择地使乳酸菌生产有益的异源基因产物。基因敲除技术已成为当前乳酸菌分子生物学研究的热点。文中对几种乳酸菌基因敲除策略研究进展及影响敲除效率的因素进行了综述,分析存在的问题并初步探讨展望了乳酸菌敲除技术的未来发展趋势。     

基因敲除策略在氨基酸产生菌代谢工程中的应用

基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术,在工业微生物代谢工程中具有广泛应用。从基因敲除技术的一般程序出发,主要介绍了工业微生物常用的基因敲除系统,重点总结了基因敲除策略在微生物代谢工程中的应用,展望了代谢工程的发展前沿和应用前景。     

干酪乳杆菌yhaI基因敲除菌株的构建及其耐药表型的分析

为了深入研究干酪乳杆菌Zhang在抗生素环境中适应性进化机制,构建yhaI基因敲除体系,并对突变体的耐药表型进行研究。运用PCR技术分别扩增yhaI基因的同源臂序列,构建带有内部缺失yhaI基因的敲除载体。采用Cre/lox基因重组系统,筛选双交换子L.casei Zhang-G-1200-yhaI::lox66-P32-cat-lox71,构建突变株L.casei Zhang-G-1200-Che yhaChe I,通过稀释法研究突变株的耐药表型。通过PCR和PCR产物经测序验证,yhaI基因缺陷的菌株构建成功。耐药表型结果表明,突变株在庆大霉素浓度为8和16 μg/mL时,浊度变为原始菌株的1/2;在庆大霉素浓度为16 μg/mL时,活菌数变为原始菌株的7/10。成功构建干酪乳杆菌Zhang的基因敲除体系,为研究干酪乳杆菌Zhang的基因功能提供了技术平台。     

植物乳杆菌降胆固醇Lp10菌株的rhaD基因敲除株的构建

以转录组数据为依据推测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中rhaD基因参与胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)合成代谢中的鼠李糖代谢过程,从而通过调节胞外多糖合成并利用其吸附作用达到降胆固醇效果。为了进一步验证rhaD基因的功能,本论文研究利用同源重组技术,构建rhaD基因敲除载体,采用电击转化方法将构建的敲除载体导入植物乳杆菌Lp10菌株感受态细胞,并在抗性平板上筛选转化子,以转化子的基因组DNA为模板进行PCR及测序鉴定,再利用邻苯二甲醛法测定突变株与初始菌株的降胆固醇能力。结果表明,敲除载体pNZ5319-rhaD被成功构建,测序结果显示rhaD基因被成功敲除;敲除菌株的降胆固醇能力略有上升。本论文研究结果不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了实验技术支持,同时为植物乳杆菌降胆固醇相关功能基因的验证分析奠定了理论依据。     

基因敲除技术及其在微生物育种中的应用

基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是研究基因功能的直接手段,而且在微生物育种方面发挥了巨大的作用。论述了基因敲除的基本原理、几种常用技术及该项技术在微生物育种方面的应用。分析存在的问题并展望了相关技术诸多领域的发展趋势。     

长双歧杆菌C16 bif黏附基因敲除菌株的构建

长双歧杆菌是定植于人体肠道中的优势菌株,与人体肠道健康密切相关.黏附是长双歧杆菌定植于肠道的前提,研究长双歧杆菌的黏附机制尤为重要.bif黏附基因作为长双歧杆菌的一类胞外黏附因子,其敲除后黏附效力是否丧失尚未明确.本试验利用同源重组技术,以长双歧杆菌为研究对象,构建bif黏附基因敲除突变株,验证该基因的黏附作用.首先以...     

维氏气单胞菌中AHLs介导的群体感应现象及大蒜提取物的干扰作用

以发酵鱼糜中分离的1株维氏气单胞菌为对象,分析该菌中N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)介导的群体感应现象,研究大蒜提取物作为群体感应抑制剂对该菌群体感应及腐败能力的干扰作用.结果表明,维氏气单胞菌至少产生3种AHLs信号分子,即C6-HSL、C7-HSL和C8-HSL.在细菌快速生长阶段,AHLs分子的活性不断增加;当细...     

发酵工业菌种改良中的基因敲除策略及应用

基因敲除是一种近年来新发展起来的分子生物学技术,该技术可通过多种策略使机体特定基因缺失或失活,从而对生物遗传物质有目的地进行改造,在发酵工业微生物菌种改良中发挥着重要作用.在此对基因敲除技术的常用策略加以总结和论述,对其在工业菌种改良中的应用进行了简要介绍,同时展望了这项技术的发展趋势.     

单增李斯特菌srtA基因敲除菌株的构建及其生物学特性

单核细胞增生性李斯特菌是常见的食源性致病菌,其细胞壁上存在的表面蛋白与其致病性和细菌菌膜的形成密切相关,而srt A基因是介导表面蛋白膜表面定位的关键因子,通过识别特定的蛋白序列将表面蛋白共价结合在细胞壁上,也是单增李斯特菌的重要毒力基因。为深入研究srtA的功能及其对细菌毒力的调控,本研究通过同源重组技术敲除了单增李斯特菌中的srt A基因,并对基因敲除菌株的生物学特性进行了初步研究。通过生长曲线的测定,发现srtA基因敲除株的生长活性低于野生型菌株。进一步利用该菌株对星形胶质细胞系U251的侵袭实验发现,srtA基因敲除菌株的侵袭效率低于野生菌株,提示srtA基因在调控单增李斯特菌的侵袭能力方面发挥重要作用。本研究可为单增李斯特菌毒力基因调控和细菌菌膜的研究提供理论依据。     

pH和NaCl质量浓度对发酵鱼糜中腐败菌Aeromonas veronii bv. veronii群体感应的影响

细菌通过群体感应(Quorum sensing,QS)系统来调控自身一些代谢行为,如生物膜的形成、鞭毛运动等,可引起食品腐败和食源性疾病,分析环境因素对细菌QS的影响对控制水产品质量安全具有重要意义。该研究以从发酵鱼糜中分离的腐败菌Aeromonas veronii bv.veronii为研究对象,利用生物报告菌根癌农杆菌及激光共聚焦显微镜等技术分析了pH(6.0、7.0、8.0)和Na Cl(5、10、20 g/L)对细菌N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactone,AHL)类信号分子介导的QS及代谢行为的影响。研究发现,培养基初始pH 8.0或NaCl质量浓度为20g/L时能显著降低细菌产生的AHLs活性、生物膜形成能力及泳动能力(p0.05)。由此认为,通过控制环境中的pH和Na Cl质量浓度能影响细菌合成AHLs及其QS系统的表达,并调控细菌的代谢行为。     

鱼类产品中嗜水气单胞菌RPA结合CRISPR/Cas12a快速检测

本文收集了来自水产养殖企业的74例鱼类样品, 采用基于最新的成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)基因编辑技术建立重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)结合CRISPR/Cas12a新方法, 快速检测鱼类样品受嗜水气单胞菌感染水平; 同时采用等温扩增LAMP方法进行检测, 比对分析两种方法的检出率。同时对分离出来的嗜水气单胞菌作耐药性分析, 分别采用纸片扩散法(K-B)测定分离株的耐药表型, 采用SYBG实时荧光PCR方法测定分离株的耐药基因, 分析耐药表型与耐药基因检测结果的一致性。结果表明, 检测了74例鱼类样品, 基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP方法同时检测出6例嗜水气单胞菌阳性。分析耐药性结果, 嗜水气单胞菌分离株对氨基糖苷类的卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素比较敏感, 对氯霉素类的氟苯尼考比较敏感, 对于其余药物产生不同程度的耐药。耐药基因分别检出四环素类tetA、喹诺酮类qnrA、qnrD和qnrS、磺胺类sul 1和sul 2、氯霉素类cmlA、floR和cfr; 分析耐药表型与耐药基因检测结果一致性较高。研究结果有助于提高鱼类产品中嗜水气单胞菌及耐药性快速检测水平。     

武汉地区食源性沙门氏菌耐药特征分析

目的分析武汉市售肉类中分离的82株沙门氏菌的药物敏感性及耐药基因。方法根据美国临床和实验室标准协会(Clinical&Laboratory Standards Institute,CLSI)相应标准获得沙门氏菌耐药实验种类和浓度,定制药敏板,采用最低抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration,MIC)进行药敏实验,并通过PCR方法检测耐药基因的携带情况。结果药物敏感性试验结果显示,82株沙门氏菌对四环素耐药率最高,有66株菌株对四环素耐药,耐药率高达79.52%,对复方磺胺和氨苄西林的耐药率较高,耐药率分别为49.40%和48.19%;对头孢类药物的耐药率较低,对亚胺培南未表现出耐药性。耐药基因检测结果显示,82株沙门氏菌中四环素耐药基因tetA的检出率最高,且有54株沙门氏菌携带多重耐药基因,头孢类药物耐药基因blaCTX检出率较低,仅为3.66%。结论武汉市食源性沙门氏菌耐药情况较为严重,部分常见抗生素耐药性较高,对临床用药治疗和食源性病菌预防造成巨大的影响。     

一株耐高乙醇和低pH己酸产生菌Lysinibacillus fusiformis- pBE3-ep-SigB的构建

以Lysinibacillus fusiformis为出发菌,分别转染SigA和SigB突变基因,获得耐高乙醇和低pH胁迫的优良己酸产生菌。以pET32a（+）-SigA/SigB为模板,采用均匀试验优化SigA/SigB易错聚合酶链式反应（ep PCR）扩增体系中的Mn2+和Mg2+浓度,通过ep PCR获得ep-SigA/SigB突变基因,与载体pBE3-MCS连接后,构建L. fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB突变菌体库,将两种菌体库在pH值2～5和乙醇含量2%～12%条件下进行筛选。结果表明,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株耐受最高乙醇含量为8%左右,最低耐受pH值为2.5左右;当乙醇含量为8%、pH值为3.5时,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株的己酸产量达到（254.35±39.74） mg/100 mL,显著高于工程菌株L. fusiformis-pBE3-ep-SigA的己酸产量（P＜0.01）,且为出发菌L. fusiformis己酸产量（93.62±10.33） mg/100 mL的271.68%,表明L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株具有较强的抗高乙醇浓度和低pH值胁迫产己酸的能力。     

Prevalence, characterization, and antimicrobial resistance of Aeromonas strains from various retail food products in Mumbai, India

A total of 154 food samples (chicken, fish, and ready-to-eat sprouts) from various retail outlets in Mumbai, India, were analyzed for the presence of Aeromonas spp. over a period of 2 y (January 2006 to March 2008). Twenty-two Aeromonas isolates belonging to 7 different species were isolated from 18 (11.7%) food samples. The highest percentages of isolation were from chicken (28.6%) followed by fish (20%) and sprout (2.5%) samples. Aeromonas caviae, A. veronii bv. sobria, and A. salmonicida were the most frequently isolated species from sprouts, chicken, and fish samples, respectively. The genes encoding for putative virulence factors, cytotoxic enterotoxin (act), hemolysin (hly), aerolysin (aer), elastase (ahyB), and lipase (lip) were detected using polymerase chain reaction method in 59.1%, 40.9%, 22.7%, 54.5%, and 31.8% of the strains, respectively. The isolated Aeromonas strains were found to be positive for virulence factors, that is, amylase, DNase, gelatinase, protease, and lipase production. More than 60% isolates were also positive for β-hemolytic activity. All these food isolates were found to be resistant to ampicillin and bacitracin, and sensitive to gentamicin, 3rd-generation cephalosporins (ceftazidime, cephotaxime, ceftriaxone), and chloramphenicol. Seventeen (77.2%) isolates harbored single and/or multiple plasmids (approximately 5 to >16 kb). The XbaI digestion patterns of chromosomal DNA of these isolates, using pulsed field gel electrophoresis, showed high genetic diversity among these isolates. Our results demonstrate the presence of various Aeromonas spp. with virulence potential and antimicrobial resistance in different food products marketed in Mumbai, India. The potential health risks posed by consumption of these raw or undercooked food products should not be underestimated.     

市售鲫鱼体内菌株及其抗生素耐药性分新

分离健康鲫鱼体内菌株,通过显微镜观察和16S rDNA分析对菌株进行鉴定,并进行产纤维素酶和淀粉酶菌株筛选。分离到的菌株分别属于假单胞菌、气单胞菌、希瓦氏菌等。在美国国家生物信息中心NCBI Genbank基因库中提交了其中两个菌株16S rDNA序列,登录号是:FJ796224和FJ796225。筛选到多株产淀粉酶菌株,其中产酶活性较高的菌株命名为Aeromonas veronii F2。在鲫鱼肠道没有筛选到产纤维素酶菌株。抗生素检测分析显示,鲫鱼体内抗卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素三种药物的细菌有11.29%,显示鲫鱼体内菌株抗药性比从田野环境中获得的菌株高5~6倍,这需要引起人们的关注。     

密云区致泻大肠埃希菌耐药性及耐药基因研究

目的 建立密云地区腹泻患者致泻大肠埃希氏菌的毒力基因及耐药基因数据库.方法 采集腹泻患者粪便样本,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法鉴定致泻大肠埃希氏菌并确定毒力基因,采用微量肉汤稀释法确定耐药性,采用普通PCR方法对耐药基因进行检测.结果 2112份粪便样...     

金黄色葡萄球菌ST398-t571型在陕西生猪屠宰场的流行传播及其耐药性分析

目的 调查陕西省某生猪屠宰场ST398-t571型金黄色葡萄球菌的流行情况及耐药性。方法 本研究对陕西省某生猪屠宰链及屠宰场内部环境共采集485份样品。使用常规检测方法和分子生物学技术对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,然后对分离株进行分子分型鉴定和对15种抗菌药物进行耐药性试验;并对其进行26种毒力基因和13种耐药基因的检测。结果 样品中共分离出62株金黄色葡萄球菌,总分离率为12.8%;其中ST398-t571型分离株为优势克隆型,占90.3%(56/62)。耐药试验结果显示,所有受试菌株均对苯唑西林、阿米卡星、万古霉素和头孢噻肟敏感,对其余的抗菌药物表现出不同程度的耐药性。26种毒力基因中11种毒力基因(seb、seg、sei、sek、sen、seq、lukD、lukE、lukF-PV、lukS-PV、sasG)被检出。13种被检耐药基因除万古霉素耐药基因vanA基因外均有检出。结论 屠宰场生猪屠宰链普遍存在以ST398-t571型为主的金黄色葡萄球菌污染,不同批次分离株基因携带情况存在一定差异且菌株存在较为严重的耐药性。     

1株食源性蜡样芽胞杆菌分离株的分子特征毒性及耐药性研究

目的 研究株蜡样芽胞杆菌SCY分离株的毒力和耐药性。方法 使用选择性培养基从银川市某餐厅鱼肉菜肴中培养分离获得蜡样芽胞杆菌SCY分离株,经23S rRNA基因PCR测序鉴定后,通过二代全基因组测序技术分析SCY分离株的基因组特征,进而分别采用免疫组化技术和药敏纸片实验研究SCY分离株的毒性和耐药性。结果 SCY分离株的基因组大小为5.82 Mb,编码基因个数为5 767,编码区总长度占全基因组的85.50%。SCY分离株基因组中共含有11个基因岛、16个CRISPR和5个前噬菌体;其中,SCY编码基因分别在PHI和VFDB毒力因子数据库中注释到了14个和62个毒力基因（Identiy>80,Evalue<0.05）,在CARD耐药数据库中注释到了215个耐药基因（Best Hit evalue<0.05）。小鼠肠道组织切片免疫组化结果表明,炎性因子IL-1β、CASP1和Nlrp3的表达水平发生差异显著性上调。22种细菌抗生素药敏纸片试验结果显示,SCY分离株对氯霉素、克林霉素等高度敏感,对四环素、头孢唑啉、头孢哌酮、氨苄青霉素表现为中介,对青霉素、苯唑西林、哌拉西林、杆菌肽、头孢他啶等10种抗生素表现为耐药,SCY分离株多重耐药情况较为严重。结论 本研究发现的SCY分离株属于肠毒株,携带多种肠毒素毒力基因,且具有典型的多重耐药特征。研究结果为揭示蜡样芽胞杆菌分离株的致病机制提供参考依据。