环丙沙星生物条形码检测技术的研究

该文对快速检测食品中环丙沙星残留的生物条形码检测技术进行研究。首先将环丙沙星多克隆抗体与条形码DNA 链共同修饰在纳米金颗粒上制备纳米金复合探针、环丙沙星单克隆抗体与磁性颗粒结合制备磁性探针,然后对其采用可见光光谱法、透射电镜法进行鉴定;其次将上述探针与环丙沙星标准品进行杂交反应,在磁场的作用下,去除未结合的纳米金复合探针,然后收集标记成功的纳米金复合探针释放出的DNA 链,采用微孔板银染的生物条形码技术进行检测,得到环丙沙星残留量。检测环丙沙星的最低检出限为2.13 ng/mL。该方法与常规免疫检测方法相比灵敏度增强,具有实用性,为未来检测小分子物质残留量提供了新思路,也为制备环丙沙星生物条形码检测试剂盒奠定了基础。     

达氟沙星残留生物条形码检测技术的建立

将达氟沙星多克隆抗体和条形码DNA链同时修饰在金纳米颗粒表面用于制备纳米金复合探针（NP）,达氟沙星单克隆抗体与磁性颗粒相结合制备磁性探针（MMP）,待上述两种探针制备成功后与达氟沙星标准品进行杂交反应,同时发挥磁场作用固定MMP,除去未结合的NP探针,最后将标记在金纳米复合探针上的DNA链释放出来,对收集释放的DNA链应用微孔板银染的生物条形码技术进行检测间接得到达氟沙星的残留量,该检测方法不需要昂贵的仪器设备,普通实验室利用酶标仪即可完成全部实验操作,操作简单,检测速度快,其检测灵敏度要优于传统的酶联免疫吸附法。结果表明,在0.05~50 ng/mL范围内检测达氟沙星的最低检出限IC15为3.62 ng/mL,其检测灵敏度是常规免疫检测方法的100倍。本方法实现了对达氟沙星残留的超高灵敏度检测,同时本方法也可应用于其它类抗生素的高效快速检测,因此,本方法的建立具备一定的实用性。     

基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157:H7检测

建立一种基于生物条形码探针和金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)对致病性大肠杆菌O157:H7检测的新方法。用生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)和AuNPs与目标物大肠杆菌O157:H7进行免疫反应,形成MNPs/目标物/AuNPs“三明治”式复合体。利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来,通过DNA探针杂交条形码DNA引起AuNPs颜色变化来确定大肠杆菌O157:H7的存在,这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析,该方法在纯样品和牛奶中最低检测限为102CFU/mL,检测范围为102～106CFU/mL。应用基于生物条形码探针和AuNPs对大肠杆菌O157:H7检测具有准确、快速、操作简单的优点,为食品安全监测提供了新的方法。     

氧氟沙星完全抗原的合成鉴定及其单克隆抗体的制备纯化

本试验通过碳二亚胺(EDC)法把氧氟沙星(OFLX)与载体蛋白BSA和OVA分别进行偶联制备免疫抗原和包被抗原,并采用紫外扫描法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对合成抗原进行了鉴定。通过杂交瘤常规技术获得了抗OFLX的单克隆抗体杂交瘤细胞株7株,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行了纯化。纯化腹水均属IgG1型。经过ELISA方法鉴定,纯化后的抗体效价>1:128000;交叉实验证明所得抗体与达氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、泰乐菌素均没有交叉反应,表现了良好的敏感性和特异性。     

磁弛豫开关技术在生物检测应用中的研究进展

本文主要介绍磁弛豫开关技术在生物检测应用中的研究进展。磁弛豫开关检测技术是核磁共振技术、纳米技术和生物免疫技术相结合的一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的快速检测技术。以修饰了生物配体的磁性纳米颗粒作为磁共振探针,该探针能特异识别某一物质,当与待测物发生特异性结合后,磁性纳米颗粒由分散态变成聚集态,使得水质子的横向弛豫时间(T2)发生改变,从而实现对待测物的检测。目前磁弛豫开关技术已经广泛应用于蛋白质、微生物、核酸、小分子等生物分子的检测,并取得了一定的成果。基于磁学信号的磁弛豫开关检测技术具有抗干扰能力强,适用于复杂基质检测的特点,使得该技术在食品安全、环境检测、临床诊断等领域都有着广阔的应用前景。     

免疫金探针的应用及制备

早在几百年前,人们就开始对金溶胶进行了研究。一直到18世纪后,Faraday利用科学的方式对其进行研究,成为将其研究方式转换为科学方式的第一个引领者。在此之后,人们对金溶胶的合成的研究方向开始转移到对其合成的方式以及其本身所具备的性质和其应用方向等,随着纳米科技的出现,其本身具备的独特性质使其开始被广泛地应用于各个领域。近几年,免疫金探针开始在各个领域发展起来,由此,免疫金探针这一新颖的研究课题开始被人们所熟知,人们对于其的研究从开始的基础研究到后面的研究不断深入。本文主要对免疫金探针当前的应用情况以及其制备的方式进行分析介绍。     

生物检测技术在食品检验中的研究

近年来,人们的生活水平逐渐提高,食品安全意识也越来越高,在一定程度上加快了食品检验工作的创新与发展,尤其是生物检测技术的普及应用,获得了非常好的成效.生物酶技术、生物芯片技术、生物传感技术以及分子生物技术是当前食品检验中应用最广泛的先进技术,在食品成分检验、有害微生物检验、转基因检验以及农药残留检验等方面发挥着至关重要...     

抗葡聚糖单克隆抗体制备的研究

本文对抗葡聚糖单克隆抗体制备进行研究,采用新的载体偶联技术和免疫方法,已成功获得4株抗葡聚糖单抗杂交瘤,并证明是葡聚糖特异性的.为研制快速、定量准确的葡聚糖免疫学检测国产试剂盒打下基础.     

克诺罗杆菌检测用单克隆抗体的制备及功效评价

目的:选择克诺罗杆菌标准菌株中的多株代表菌株作为抗原,采用多抗原组合免疫的方法,筛选制备抗克诺罗杆菌属（Cronobacter spp.）检测用单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）,并对获得的抗体进行各项指标评价,为进一步建立克诺罗杆菌免疫学快速检测方法创造条件。方法:采用冻融裂解、超声破碎、全颗粒三种方法制备抗原,以克诺罗杆菌标准菌株及分离菌株20株,9株非克诺罗杆菌进行筛选。筛选获得的抗体鉴定特异性,进行Ig亚类分型,测定效价及相对亲和力常数。结果:获得6株针对克诺罗杆菌的杂交瘤细胞株,腹水效价均在1∶107以上;相对亲和常数均大于1.0×1010L/mol。采用\     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联 免疫吸附检测方法的建立

目的 制备地西泮(Diazepam DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法 利用EDC法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附,SPR等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果 成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(KDs)为4.0985×10_-7M,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC₅₀=10.8ng/mL,检测范围为0.45ng/mL-862ng/mL。结论 制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

赭曲霉毒素A单克隆抗体的体外制备及其重组抗体的构建研究

目的 实现抗赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)单克隆抗体的体外制备及其重组抗体表达载体的构建与瞬时转染表达。方法 以前期获得的OTA杂交瘤细胞株(O16)为研究对象,通过无血清驯化培养的方式开展OTA单克隆抗体的体外制备研究;采用简并引物法获取OTA杂交瘤细胞的单克隆抗体编码基因,在此基础上构建OTA重组全长抗体表达载体以及OTA重、轻链可变区基因片段与人源恒定区片段连接的重组嵌合抗体表达载体,并基于哺乳动物细胞系,开展两种重组抗体的瞬时转染表达研究。结果 通过缓降血清浓度的方式对OTA杂交瘤细胞进行无血清驯化,实现了体外培养制备OTA单克隆抗体;在此基础上测得OTA单克隆抗体的重链和轻链基因序列,并成功构建了OTA重组全长抗体表达载体(pCDNA3.4-OTA-H/L)和重组嵌合抗体表达载体(p FUSE-OTA-H/L),通过共转染实现了两者在哺乳动物细胞系中的瞬时转染表达;经间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)确定体外培养制备的OTA抗体、OTA重组全长抗体和嵌合抗体均具备特异性结合抗原的能力,三者的...     

腈菌唑单克隆抗体制备与胶体金检测方法的建立

目的 制备高灵敏度腈菌唑单克隆抗体,建立芹菜样本中腈菌唑胶体金快速检测方法。方法 对腈菌唑化学结构进行改造,合成两种半抗原,与载体蛋白偶联,免疫小鼠,制备单克隆抗体。结合胶体金技术,优化抗体标记参数等,建立胶体金的检测方法,并对检测性能进行评价。结果 由所制备的单克隆抗体开发的胶体金试纸条半数抑制浓度为2.10μg/L,线性范围为0.62～7.25μg/L,与其他三唑类杀菌剂和芹菜中常见杀虫剂的交叉反应率均小于5%;可定性检测芹菜样本中腈菌唑是否超过GB2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》限量,检出限为50μg/kg;通过实际阳性样本测试与气相色谱-串联质谱法比较,符合性较好,结果可靠。结论 基于两种半抗原免疫制备的抗体,可建立腈菌唑胶体金检测方法,检出限满足国家标准限量要求,可应用于现场的快速筛查。     

环戊二烯类有机氯农药单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备并鉴定环戊二烯类有机氯农药单克隆抗体。方法以环戊二烯类农药的特征部分为基础设计合成半抗原4-(4,5,6,7,8,8-六氯-3a,4,7,7a-四氢-4,7-亚甲基-1H-聚-1-氧)4-丁酮酸(CCD),并通过活泼酯法将其与载体蛋白BSA、OVA分别偶联制备免疫抗原CCD-BSA和包被抗原CCD-OVA;再经过动物免疫、细胞融合,筛选、克隆,得到1株能稳定分泌环戊二烯类农药抗体的单克隆细胞株。细胞株经扩大培养后,注射小鼠体内产生腹水,并将其用辛酸-硫酸铵和protein A柱子纯化出单克隆抗体。结果 用间接ELISA方法测定其效价为2.5×104,亲和力Ka为6.7×1010L/mol;以β-硫丹为竞争物,采用间接竞争ELISA法建立标准曲线,测得其IC50为16.2 ng/m L,LOD为2.1 ng/m L,定量检测线性范围为4.7~117.5 ng/m L,与其他5种结构类似物的交叉反应率高于10%。结论 本研究成功获得了抗环戊二烯类农药单克隆抗体,该抗体可实现果蔬中环戊二烯类农药的多残留快速检测。     

毒死蜱单克隆抗体制备及icELISA检测方法优化

目的制备毒死蜱单克隆抗体,建立icELISA(间接竞争酶联免疫吸附方法)检测方法并对其进行优化。方法以毒死蜱为基础物质,制备半抗原CPF-H1和CPF-H2,偶联蛋白制备人工抗原,进而通过免疫、细胞融合、筛选得到特异性的单克隆抗体,建立毒死蜱的icELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。结果质谱鉴定结果表明毒死蜱半抗原制备成功;半抗原偶联蛋白,紫外全波长扫描鉴定人工抗原制备成功;免疫动物、细胞融合并制备单克隆抗体;建立了icELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:PBST为标准品稀释液,包被抗原最佳稀释倍数为1:1000,抗体最佳稀释倍数为1:1000,一抗反应最佳时间为40 min,二抗反应最佳时间为30 min,制得毒死蜱标准曲线,毒死蜱对抗体的IC_(50)为73-25 ng/mL,线性范围IC_(20)~IC_(80)为32.52~260ng/mL,LOD为19.34 ng/mL。结论本研究为毒死蜱快速检测技术奠定了理论基础,对保障人们的身体健康具有重要的意义。     

诺氟沙星单克隆抗体的制备及初步应用

采用优化的碳二亚胺法制备诺氟沙星（NOR）人工抗原,紫外扫描和红外光谱图表明人工抗原偶联成功。采用细胞融合技术筛选抗NOR单克隆抗体（NORmAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备NORmAb,建立间接竞争ELISA（icELISA）标准曲线。结果表明,筛选的3株杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1亚型,具k轻链;建立的icELISA标准曲线在PBS中的的线性检测范围为0.04～43.6ng/mL,IC50值为0.62ng/mL,检测限（LOD）为0.02ng/mL;抗体与环丙沙星（87.2%）、培氟沙星（76.9%）、依诺沙星（66.8%）、恩诺沙星（48.6%）和洛美沙星（36.6%）有较高的交叉反应率;禽肉基质中NOR添加回收率满足检测要求。     

酚酞单克隆抗体的制备

目的 建立免疫学快速检测减肥类保健食品中非法添加的酚酞, 制备酚酞单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺(carbodiimide, EDC)法合成免疫原和包被原, 用免疫原免疫Balb/C小鼠, 取小鼠脾脏与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合。采用竞争结合双阳性两步筛选法, 筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞, 利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞; 采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化, 利用酶联免疫吸附法鉴定纯化后的抗体。结果 成功合成了酚酞-BSA免疫原和酚酞-OVA包被原, 筛选获得酚酞杂交瘤细胞株FT/BSA/2019, 单克隆抗体的效价1×105。结论 本研究初步建立了特异性高的酚酞单克隆抗体的制备方法。     

大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor,KTI)单克隆抗体,以50μg/只的免疫剂量将KTI免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和敏感性,选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到稳定分泌KTI单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为157.33ng/mL,经细胞融合筛选得到4E6-E9阳性杂交瘤细胞株,所制备的抗体效价达到11 638 400,亚型为IgG1型,亲和常数为1.45×108 L/mol,IC50为28.39ng/mL,且特异性强。说明试验所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立灵敏、特异的KTI免疫学检测方法提供良好的抗体保障。     

荧光法检测鱼糜制品中大豆蛋白的研究

鱼糜制品中大豆蛋白的过量添加已成为水产食品生产的一个新问题,建立有效的检测方法尤为重要。本研究通过丙酮浸泡、酸处理、硫酸铵盐析和柱层析等步骤分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybean trypsin inhibitor,STI）并制备抗STI单克隆抗体（A11-6）。经过Protein G Sepharose柱层析分离得到高纯度的免疫球蛋白（IgG）。采用SPDP（N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶）和DTT（二硫苏糖醇）组合处理,成功将R-藻红蛋白偶联到抗STI单克隆抗体。利用该荧光标记的抗体建立的免疫荧光法能够检测出鱼糜制品中的STI,检测限为1.56μg/mL,灵敏度略高于传统的化学发光法。该免疫荧光法具有操作时间短、灵敏度高和使用安全等优点。