定点突变提高Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶催化活性

通过分析超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶基因,对6个可能提高酶催化活性的氨基酸残基进行定点突变,获得比未突变酶催化活性较高的突变子Y184H、Y121S、A109V、K98R、V125L。将以上5个突变位点集中在一个突变子上得到突变酶TSAM-23,该突变酶与未突变酶相比,酶的催化效率有较大提高,酶的活力和90℃条件下的热稳定性分别提高了3.75倍和2.4%,最适反应pH值为5.0,比未突变酶降低0.5,较之突变前有更好的工业应用价值。     

深海古菌Thermococcus siculi HJ21高温普鲁兰酶基因的克隆及表达

根据NCBI 上公布的普鲁兰酶基因的保守序列设计简并引物,以Thermococcus siculi HJ21 基因组DNA 为模板进行PCR,得到T. siculi HJ21 普鲁兰酶的基因,测序后通过Blast(NCBI)数据库比对和分析表明扩增基因有一个4056bp、编码1351 个氨基酸的开放阅读框,为一新的普鲁兰酶基因。将该基因插入表达载体pET28a,并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG 诱导,测定普鲁兰酶比活力。重组转化子的细胞破碎液有高温普鲁兰酶活性,SDS-PAGE 电泳结果显示出分子质量约为150kD 的特异性条带。     

引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响

生物信息学预测黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,并在α-螺旋处引入疏水性氨基酸以提高木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性。通过定点突变活性位点E103D、E194D,构建突变基因xyn ED。同时,将α-螺旋处氨基酸Val125、Lys178和Gly180分别突变为疏水性氨基酸Ala、Met和Ala,构建突变基因xyn MA。突变基因xyn ED和xyn MA在大肠杆菌BL21中表达发现,突变酶Xyn ED酶活性为原酶Xyn ZF-2的0.17%;突变酶Xyn MA最适温度由原来的40℃提高到了48℃;在40℃条件下保温1 h,突变酶Xyn MA酶活性仍高达74.71%(原酶Xyn ZF-2为44.36%);突变酶Xyn MA的半衰期t45℃1/2从原来的7 min提高到了19 min。因此,Glu103和Glu194为木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,且在木聚糖酶Xyn ZF-2α-螺旋处引入疏水性氨基酸能大大提高其热稳定性。     

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达

BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。     

玉米醇溶蛋白的超声辅助酶法提取工艺 及不同提取方法对其结构和功能特性的影响

以玉米蛋白粉为原料,对超声辅助α-淀粉酶提取玉米醇溶蛋白的工艺条件进行探究,并研究了超声波法、α-淀粉酶法、超声辅助α-淀粉酶法和醇法对玉米醇溶蛋白功能特性和结构的影响。结果表明：超声辅助α-淀粉酶法在超声功率密度2.85 W/cm3、超声时间35 min、超声温度45 ℃、酶添加量0.9%、酶解pH 6.0时提取的玉米醇溶蛋白蛋白质含量最高,为80.09%,显著高于超声波法(68.49%)和α-淀粉酶法(76.37%)提取的玉米醇溶蛋白;与醇法相比,超声辅助α-淀粉酶法、超声波法和α-淀粉酶法玉米醇溶蛋白的持水/持油力和乳化活性显著提高,溶解度和粒径减小,玉米醇溶蛋白二级结构更舒展,紫外吸收增强,内源荧光最大吸收峰发生红移,巯基含量升高,二硫键含量显著降低;不同提取方法对玉米醇溶蛋白的相对分子质量影响不大。     

A154C/G155C双点突变对嗜热耐酸淀粉酶酶活性及热稳定性的影响

利用重叠延伸法对嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶基因BD5088进行体外A154C/G155C双点定点突变,通过原核表达载体pET30a构建表达载体pET-BD5088C2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,酶学性质分析表明,突变淀粉酶拓宽了反应pH值范围,尤其是酸性条件下提高更为显著。BD5088淀粉酶在100℃条件下酶活力半衰期约为22min,而突变酶酶活力半衰期40min,突变酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加热60min时,突变酶酶活力仍可维持原活力的40%,而BD5088淀粉酶只能维持20%左右。说明其热稳定性得到有效的提高。另外,突变酶在中温和90℃条件下酶活力有所提高,65℃时酶活力提高将近1倍。结果表明,BD5088淀粉酶的154、155位残基的突变为Cys对维持其热稳定性起到重要的作用,并且对其酶学性质有较大的影响,可能参与了二硫键的形成。     

引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响

生物信息学预测黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,并在α-螺旋处引入疏水性氨基酸以提高木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性。通过定点突变活性位点E103D、E194D,构建突变基因xyn ED。同时,将α-螺旋处氨基酸Val125、Lys178和Gly180分别突变为疏水性氨基酸Ala、Met和Ala,构建突变基因xyn MA。突变基因xyn ED和xyn MA在大肠杆菌BL21中表达发现,突变酶Xyn ED酶活性为原酶Xyn ZF-2的0.17%;突变酶Xyn MA最适温度由原来的40℃提高到了48℃;在40℃条件下保温1 h,突变酶Xyn MA酶活性仍高达74.71%（原酶Xyn ZF-2为44.36%）;突变酶Xyn MA的半衰期t45℃1/2从原来的7 min提高到了19 min。因此,Glu103和Glu194为木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,且在木聚糖酶Xyn ZF-2α-螺旋处引入疏水性氨基酸能大大提高其热稳定性。      

嗜热杜邦菌α-淀粉酶的定向进化及高效表达

目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造,以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶（Td-amy）的随机突变文库,高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体,通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析,并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体（mTd-amy）。该突变体最适温度（60 ℃）较野生型（55 ℃）提高了5 ℃,比酶活（466.3 U/mg）较野生型（227.9 U/mg）提高至2.0倍。经序列对比,mTd-amy有四个氨基酸发生了变化,分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp,定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体,该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高,为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。     

利用随机突变探讨影响α—淀粉酶催化活性的氨基酸位点

α-淀粉酶广泛应用于食品、纺织、洗涤剂等轻工行业,在国内外酶制剂市场占有重要地位。而淀粉酶之所以起作用,很重要的原因是重要功能区域———催化区域的存在,而催化区域起作用又取决于催化中心的活性位点,因此,活性位点或周围碱基的改变可能会对α-淀粉酶的活性产生很大的影响。本文应用易错PCR技术对来源于Pyrococcus furiosus的α-淀粉酶进行随机突变,测定突变株的酶活,并进行测序鉴定,选取了其中的8个有效突变株作为研究对象,应用生物信息学的方法对这8个有效突变株进行蛋白质结构的分析,探讨不同位置不同氨基酸的突变对蛋白质分子…     

Ca~(2+)结合位点对极端嗜热α-淀粉酶ApkA高温活性及热稳定性的影响

开发耐高温α-淀粉酶是目前淀粉液化工艺的迫切需要,极端嗜热α-淀粉酶具有优良的高温活性和热稳定性,其高温适应性机制研究可以为构建耐高温α-淀粉酶提供理论依据和设计思路。通过分析来源于极端嗜热古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1的α-淀粉酶Apk A的氨基酸序列,构建Ca2+结合位点突变体Apk Ads N110A/D155A/D164A。酶学性质分析表明,与野生型Apk Ads相比,突变体Apk Ads N110A/D155A/D164A的高温活性和热稳定性明显降低。其中Apk Ads的最适反应温度为90℃,对应的绝对酶活为2946.75 U/mg;突变体Apk Ads N110A/D155A/D164A的最适反应温度为80℃,对应的绝对酶活为917.07 U/mg。Apk Ads于90℃的半衰期约为5 h,突变体Apk Ads N110A/D155A/D164A于90℃的半衰期约为2 h。本研究结果表明Apk A中Ca2+结合位点与其高温活性和热稳定性均相关,Asn110、Asp155及Asp164这三个氨基酸残基的丙氨酸替换突变不利于Apk A维持其高温活性和热稳定性。     

卡拉胶/α-淀粉酶复合冻融稳定性对馒头的影响

研究α-淀粉酶与λ-卡拉胶复合物在冻融循环过程中的酶活性及结构变化规律,并从面团的发酵性能以及馒头的孔隙分布、质构等方面分析复合物对冷冻面团特性和馒头品质的影响。结果表明：冻融3次后α-淀粉酶内源荧光猝灭,酶活下降到54%,形成的λ-卡拉胶/α-淀粉酶复合物可进一步降低酶活。添加α-淀粉酶能有效增大馒头比容,降低馒头硬度,增加弹性,但复合物对馒头质构的影响较小。添加α-淀粉酶与复合物后,馒头的气孔数量显著多于空白组,但孔洞数量和孔壁厚度均小于空白组,说明α-淀粉酶和复合物均能使馒头的内部结构更加细腻和稳定。综上结果,λ-卡拉胶/α-淀粉酶复合物对面团特性的促进作用不如单独添加α-淀粉酶,推测α-淀粉酶和λ-卡拉胶形成复合物后,多糖掩盖了α-淀粉酶的酶活性位点,削弱了酶对馒头品质的影响。     

Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶Glu51和Asp69定点突变对酶活性的影响

为确定Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶特定氨基酸与酶活性间的关系,以含壳聚糖酶基因的p CT7-CHISP6H-m Mschito质粒为模板,利用反向PCR的方法对壳聚糖酶两个可能的酶活性位点Glu51（突变成Gln51）和Asp69（突变成Asn69）进行突变,从而构建了两个单位点突变,突变质粒分别转化至Escherichia coli BL21（DE3）并经IPTG诱导表达,测定突变前后酶的比活性,突变酶（Asp69→Asn69）比活力与野生型相比几乎不变,而突变酶（Glu51→Gln51）比活力大约为野生型的10%。通过测定动力学常数发现,突变酶和天然酶Km几乎没有很明显的变化,但是突变酶（Glu51→Gln51）的Vmax与上述两种酶的Vmax相比有很明显的变化。采用DNA Star和Deep view分析软件,预测突变前后壳聚糖酶的二级结构和三级结构,结果表明,Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶Glu51极有可能是维持酶的催化活力的必需氨基酸,它的突变可能导致酶蛋白二级结构组件及氢键网络的改变,从而导致酶活力的丧失。      

槐花多酚降糖作用的研究

文章研究了槐花多酚对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验测定了槐花醇提取物中多酚含量,考察了槐花多酚对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制作用类型。结果显示,槐花醇提物中多酚含量为18.271μg/g,高于水提物;槐花多酚对这2种酶都具有一定的抑制作用,槐花多酚对α-淀粉酶活性最大抑制率仅为47.20%,槐花多酚对α-葡萄糖苷酶活性最大抑制率可达81.32%,其IC_(50)为9.16 mg/L。动力学分析结果显示,低浓度和高浓度的槐花多酚对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶活性抑制均为混合性抑制。     

金黄色葡萄球菌新型耐热核酸酶(Nuc2)的定点突变与特性分析

本研究选取了F60、A62、T102和Y135这4个可能的关键位点,采用定点突变的方法成功构建了5个Nuc2的单点和多点突变体。体外表达并纯化这些核酸酶,对其活性、耐热性和二级结构进行测定。结果表明:经方差分析（p<0.05）,T102M和F60A/A62L/T102M/Y135V的核酸酶活性与野生型相比较显著下降,并且F60A/A62L/T102M/Y135V的酶活性基本丧失;T102M和F60A/A62L的耐热性明显弱于野生型;T102M和F60V/A62L的二级结构中α-螺旋结构的含量明显低于野生型,F60A/A62L/T102M/Y135V的二级结构中包含有无规卷曲。因此,推断T102是维持Nuc2核酸酶活性、耐热性和二级结构稳定的一个关键位点;F60、A62、T102和Y135及其与邻近氨基酸之间的相互作用对维持Nuc2的性质稳定起着重要作用。      

耐酸耐高温α-淀粉酶及其菌种选育研究进展

耐酸耐高温α-淀粉酶能在高温与低p H下水解淀粉,是重要的新型工业酶制剂。概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的热稳定性、p H稳定性及金属离子对其的影响,阐述了产酶菌种的主要来源现状,并重点对耐酸耐高温α-淀粉酶诱变育种的复合诱变、基因工程定点突变等菌种选育和古菌的相关研究进行了综述。     

银耳多糖对淀粉消化酶的抑制作用及其机理研究

目的:研究银耳多糖对胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用及机制。方法:以干银耳为原料,分别采用碱法提取、酶法脱蛋白和柱层析分离,得到总糖含量为92.45%的银耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharide,TP）,采用可见光分光光度法分析了TP对胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,采用荧光光谱法和圆二色谱法表征了TP对该两种酶结构的影响。结果:TP能抑制该两种酶的活性,其对胰α-淀粉酶的抑制作用明显高于α-葡萄糖苷酶,对该两种酶的半抑制浓度（IC₅₀）分别为7.6835和16.9306 mg/mL。TP通过与该两种淀粉消化酶发生相互作用抑制其活性。TP与胰α-淀粉酶相互作用明显,可静态猝灭此酶,改变其二级结构;TP与α-葡萄糖苷酶相互作用微弱,不能改变其二级结构。结论:TP通过与淀粉消化酶发生相互作用抑制其活性。     

60 Hz低频电磁场对α-淀粉酶催化效率的影响及作用机理

为了研究低频电磁场对酶促反应的影响及其作用机理,本文以α-淀粉酶催化水解玉米淀粉为酶促反应模型,使用60 Hz低频电磁场(LF-EMF)进行持续辐射处理,通过分析低频电磁场辐射对酶促淀粉水解反应效率的影响,以及低频电磁场辐射对底物结构、酶结构、及溶液体系传质等方面的影响,初步探讨了低频电磁场对酶促反应影响的作用机理。结果表明:低频电磁场可促进α-淀粉酶催化的淀粉水解反应,反应10 h时,产水解糖达14.39 mg/mL,比对照实验(12.41 mg/mL)提高了15.90%(p0.05);低频电磁场对玉米淀粉的形貌及结晶度无显著影响(p0.05);未发现低频电磁场引起α-淀粉酶一级结构的明显变化,也未发现低频电磁场辐射导致酶的二级结构/三级结构不可逆的改变(p0.05);低频电磁场可降低α-淀粉酶催化反应体系的最适离子强度(0.0947 mol/L),并降低高离子强度对酶促反应的抑制作用;氯化钠的扩散实验表明低频电磁场可促进溶液体系的传质,其中,离子扩散的增强因子为1.23,表观膜厚度由1.26 cm减少到1.08 cm,降低了14.29%(p0.05)。LF-EMF辐射提高了α-淀粉酶催化玉米淀粉水解的反应效率,原因之一是强化了反应传质,但不排除其影响α-淀粉酶的构象进而提高酶活性的可能性。     

青柿子提取物抑制消化酶活性与降血糖效应

为探究青柿子提取物对人唾液α-淀粉酶(HSA)、猪胰腺α-淀粉酶(PPA)、α-葡萄糖苷酶(α-Glu)的抑制作用及餐后血糖变化,以青柿子为原料,采用超声辅助丙酮萃取和大孔树脂纯化法制备青柿子提取物,通过酶活性抑制率分析、酶动力学分析和酶荧光猝灭试验研究青柿子提取物体外抑制酶的效果及机制;通过小鼠实验验证青柿子提取物对餐后血糖水平的控制作用。结果表明:青柿子提取物抑制HSA、PPA、α-Glu活性,抑制类型均为混合性抑制,半抑制浓度值(IC50)分别为(16.18±0.17),(13.57±0.30),(3.22±0.03)μg/mL;HSA、PPA、α-Glu酶与青柿子提取物均有1个结合位点,说明青柿子提取物作用于HSA、PPA、α-Glu酶的荧光发色基团,自发形成复合物,引起HSA、PPA、α-Glu酶发色基团周围微环境的改变和酶内源性荧光淬灭,从而抑制酶活性。动物实验表明青柿子提取物可明显降低小鼠餐后血糖水平,提示青柿子提取物通过抑制淀粉酶和葡萄糖苷酶活性来降低餐后血糖水平。     

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a,实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温α-淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。经多步纯化,重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312.7U/mg蛋白和354.6U/mg蛋白,纯化倍数分别为75.90和83.83,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,AMY及AMYD酶分子质量均为63.5ku。重组酶AMY的最适温度80℃,最适反应pH为6.5,在温度低于90℃,反应pH5.5~7时,酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃,最适反应pH为4.5,在温度低于90℃,反应pH4.0~6.5时,酶活较稳定。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。