荧光假单胞菌蛋白酶水解牛乳的免疫活性研究

受试小鼠分别灌喂生理盐水、低剂量(100mg/kg·bw,组Ⅰ)及高剂量(250mg/kg·bw,组Ⅱ)荧光假单胞茵蛋白酶水解脱脂奶粉形成的水解液,30 d后测定其免疫活性指标,就其水解液对小鼠免疫功能的影响进行了试验研究.结果显示: 低剂量可明显增强脾脏指数(P＜0.05),而对胸腺指数影响不明显;高、低剂量对小鼠脾淋巴细胞增殖能力也无显著影响;但高剂量可显著增强单核巨噬细胞吞噬功能(P＜0.05);24h及48h高、低剂量对小鼠迟发型变态反应和抗体细胞生成能力均有显著的增强作用(P＜0.05);表明脱脂奶粉的荧光假单胞菌蛋白酶水解液可以提高小鼠免疫功能.关键字:荧光假单胞茵蛋白酶(PFP);脱脂奶粉;小鼠;免疫功能 蛋白酶水解脱脂奶粉形成的水解液,30 d后测定其免疫活性指标,就其水解液对小鼠免疫功能的影响进行了试验研究.结果显示: 低剂量可明显增强脾脏指数(P＜0.05),而对胸腺指数影响不明显;高、低剂量对小鼠脾淋巴细胞增殖能力也无显著影响;但高剂量可显著增强单核巨噬细胞吞噬功能(P＜0.05);24h及48h高、低剂量对小鼠迟发型变态反应和抗体细胞生成能力均有显著的增强作用(P＜0.05);表明脱脂 粉的荧光假单胞菌蛋白酶水解液可以提高小鼠免疫功能.     

假单胞菌胞外弹性蛋白酶的纯化研究

假单胞菌的发酵液经过硫酸铵盐析、透析、DEA E-Sephadex A25阴离子交换层析、Sephadex G75凝胶过滤层析等纯化步骤,获得了较纯的酶蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳:分离胶12%、压缩胶4%,15m A、30m A恒流电泳后,采用考马斯亮蓝染色和银染色,并用H PLC检测,将蛋白质转移到PV DF膜上,N-端测定10个氨基酸序列。结果表明:SDS-PAGE电泳得到单一条带,H PLC检测活性峰为单峰。该酶在SD S-PAG E上测得的分子质量为32000Da,N-端氨基酸测序结果为APPSNLM QLP。     

鱼源荧光假单胞菌生物被膜形成和致腐表型的研究

荧光假单胞菌是养殖鱼类低温贮藏中的优势腐败菌。本研究比较分析5种荧光假单胞菌的生物被膜形成和腐败表型。采用结晶紫法、苯酚硫酸法、珠涡流法和荧光显微镜观察荧光假单胞菌的生物被膜形成和粘附能力,并测定细菌泳动性、蛋白酶活性、嗜铁素等致腐表型。结果表明,5株荧光假单胞菌在28℃LB肉汤中生长良好,经24 h培养后气-液界面上出现较厚的膜,在微孔板中生物被膜形成较快,其中鱼源PF01、PF06、PF07和PF10分离株在12 h含量最高,而标准菌株PFuk4在18 h最高。随着培养时间延长,细菌胞外多糖的含量逐步积累,在18～24 h达到最高,并较快粘附到不锈钢片表面,其中PF07的粘附量最高。5株荧光假单胞菌还具有较强的泳动性和蛋白酶活性,且均产嗜铁素。在PF07和PFuk4中还检测出短链高丝氨酸内酯(AHLs)活性,可能与其较高的被膜、粘附能力、泳动性及蛋白酶活性有关。本研究结果为从AHLs角度探究荧光假单胞菌的致腐机理打下良好的基础。     

荧光假单胞菌防治甜菜立枯病试验研究

应用荧光假单胞菌处理种子防治甜菜立枯病效果优良。三年的试验和示范结果表明：防治效果达７５％以上，显著优于目前生产上应用的福美双拌种剂，并优于或相当于福美双、土菌消混剂，同时还具有十分明显的促进幼苗生产势的作用是一种很有应用开发前景的生物防治菌剂。     

绿原酸对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的抑制作用

首先以群体感应报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,确定绿原酸的群体感应抑制活性,结合HPLC-MS/MS检测其对荧光假单胞菌释放信号分子的影响。以胞外酶活性、嗜铁素、群集与泳动为评价指标,通过添加外源信号分子分析绿原酸对荧光假单胞菌群体感应活性及腐败特性的调控作用。结果表明:在不影响荧光假单胞菌正常生长的剂量下,绿原酸可以减少其信号分子的产生,明显抑制荧光假单胞菌嗜铁素的产生、胞外蛋白酶、胞外脂肪酶活性、群集与泳动等相关腐败特性,且随着绿原酸浓度的升高,抑制效果更趋明显。因此,绿原酸具有较好的群体感应抑制活性,该研究为绿原酸作为群体感应抑制剂的开发提供了理论支持。     

基于群体感应研究苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用

为探究苦丁茶多酚对分离自卵形鲳鲹的腐败菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的抑制作用,本文以报告菌株紫色杆菌(Chromobacterium violaceum) CV026 为检测模型,测定了苦丁茶多酚对细菌的群体感应抑制活性,以胞外酶活性、生物被膜形成量及形态、群集与泳动性为指标,测定了苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用。结果表明:苦丁茶多酚对CV026、荧光假单胞菌的最小抑菌浓度分别为2.1、3.0 mg/mL;在亚抑菌浓度下,苦丁茶多酚可以显著降低紫色杆菌CV026 紫色菌素的产生量（P<0.05）;当浓度为2.0 mg/mL 时,对紫色菌素的抑制率达68.89%,且不影响CV026 菌株的生长;苦丁茶多酚能有效抑制荧光假单胞菌胞外酶活性、生物被膜形成、群集与泳动能力等相关腐败特性,其抑制作用呈剂量依赖性,苦丁茶多酚浓度为2.0 mg/mL时,对蛋白酶、脂肪酶活性、生物被膜形成、群集和泳动能力的抑制率分别达到80.68%、53.50%、44.90%、79.56%和90.12%;苦丁茶多酚具有较好的群体感应抑制活性,可以为新型天然群体感应抑制剂研发提供参考。     

假单胞菌SWU-M生产弹性蛋白酶发酵条件的研究

研究弹性蛋白酶的产生与发酵条件,应用微生物学方法从牛肚中分离筛选了1株弹性蛋白酶用于生产菌株PseudomonassspSWU-M。研究结果表明,产生弹性蛋白酶的最佳发酵条件是:蔗糖6%、葡萄糖2%、干酪素3%、Na2HPO40.4%、MgSO·47H2O0.01%,起始pH值为7.0,摇振转速为150r/min。在后12h添加营养素和变温培养能提高酶的产量。     

食源假单胞菌16S rRNA鉴定及其食品腐败特性的研究

从市售鱼中分离的三株革兰氏阴性菌FML05-1、FML05-2、FML05-3,经16s rRNA鉴定为假单胞菌属。该菌是一种导致食品腐败的重要腐败细菌。选取代表菌株的16S rRNA序列,利用phylip软件网上构建系统进化树,同时对其蛋白水解活性、嗜铁素产生和生物膜形成等与食品腐败相关的特性进行检测,发现FML05-2具有很强的蛋白水解活性和生物膜的形成能力,并且在脱脂牛奶中生长还产生大量的嗜铁素,菌株FML05-1具有很强的生物膜形成能力,但蛋白水解活性较弱,在LB及脱脂牛奶中生长均不产生嗜铁素,而菌株FML05-3不具有上述三种特性。     

大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究

本文以大菱鲆分离的荧光假单胞菌作为研究对象,紫色杆菌CVO26平行划线法检测信号分子。不同碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖)的AB培养基培养并检测其生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生量,同时添加外源的信号分子标准品,研究AHLs与腐败因子之间的相关性。研究表明:大菱鲆分离的荧光假单胞菌能够发生群体感应现象,经不同碳源培养,其腐败因子产生情况有明显差异,碳源的添加对生物被膜的产生有促进作用,对胞外蛋白酶的产生没有显著影响;以葡萄糖、麦芽糖为碳源,生物被膜的产生量较高;以蔗糖和乳糖为碳源,嗜铁素的产量较高。添加外源信号分子标准品,生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生量有显著提高。因此,生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生与AHLs有关,群体感应现象可调控腐败特性的表达,并在水产品腐败过程中发挥作用。     

制备条件对生姜浸提物抑制荧光假单胞菌活性的影响

研究使用水和乙醇作为提取剂对生姜浸提制得提取液,确定最佳的料液比分别为1∶12和1∶14。并且探究微波辅助浸提所制得的提取液对荧光假单胞菌的抑制效果,可知微波辅助水浸提的最优条件为料液比1∶12,微波功率200 W,提取时间3min。微波辅助乙醇浸提的最优条件为料液比1∶14,微波功率150 W,提取时间2.5min。     

章鱼消化道蛋白酶的分离纯化及性质

以章鱼加工下脚料消化道为原料,经硫酸铵沉淀、纤维素CM-52阳离子交换层析、DEAE-Sephadex A50阴离子交换层析、SDS-PAGE电泳等方法,从中提取纯化出一种蛋白酶电泳纯样品OP-I,并对其性质进行研究。结果表明：该酶分子质量为80.5kD。最适反应温度为55～60℃,pH值为7～9。金属蛋白酶抑制剂(EDTA)可以完全抑制该酶的活性。Mn2+、Ca2+、Mg2+对OP-I有激活作用,酶促动力学研究显示其米氏常数Km为0.33mmol/L,Vmax为66.7mg/(mL ·min)。     

一株深海来源苏云金芽孢杆菌SWJS07所产蛋白酶的分离纯化及性质研究

利用超滤、硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephadex G-75分子筛柱层析对一株南海深海来源菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)SWJS07所产蛋白酶进行分离纯化,纯化后经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,相对分子质量为37.0 k Da,酶的比活力提高了6.39倍,回收率为37.14%。研究其酶学性质表明,该蛋白酶最适催化温度为55℃,在30℃~45℃下稳定性较高,保温300 min残留酶活在80%以上;最适p H 6.5,在p H 6.0~9.0蛋白酶稳定,4℃放置24 h残留酶活在80%以上;2 m M Ca2+、Mn2+对蛋白酶有不同程度的激活作用,而Hg2+、Cd2+、Al3+则强烈地抑制蛋白酶活;当在蛋白酶中添加2 m M Ca2+、Mn2+时,其最适催化温度分别为60℃和55℃,蛋白酶活分别提高了32.86%和28.35%,60℃保温30 min相对酶活基本保持不变,与纯酶(相对酶活残留21.02%)相比蛋白酶的热稳定性显著提高;EDTA-Na2可强烈抑制蛋白酶活,推测该蛋白酶属于金属蛋白酶。     

表面活性剂稳定性碱性蛋白酶纯化及性质研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XG12发酵液中分离纯化表面活性剂稳定性碱性蛋白酶,并对酶学性质进行研究。利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法,分离纯化到了均一的酶蛋白,酶纯度提高了42.6倍,回收率为25.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基蛋白,分子质量约为29.5kD。在pH7.0～11.0范围内酶活性及稳定性较高,最适作用pH值为10.0,最适作用温度40℃。Mg2+、Ca2+及Mn2+对酶有明显激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性,表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。酶分别对终质量浓度为0.1g/100mL的阴离子表面活性剂SDS、阳离子表面活性剂CTAB和体积分数为1%的非离子型表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100以及氧化剂均具有很强的稳定性。     

安卡红曲霉酸性蛋白酶分离纯化及部分酶学性质分析

安卡红曲霉（Monascus anka）CICC 40806培养液经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析两步分离纯化,得到纯度较高的胞外酸性蛋白酶,然后对其性质和动力学进行研究。结果表明M.?anka酸性蛋白酶的最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.0～7.0,最适反应温度为50?℃,低于50?℃时酶具有较好的稳定性,50?℃时的衰减常数为0.569。M.?anka酸性蛋白酶以酪蛋白为底物时反应活化能为28.85?kJ/mol,相对较低。M.?anka酸性蛋白酶具有一定的耐盐性,当NaCl质量分数为7%时,最适条件下反应时相对酶活力为12%。以酪蛋白、米渣蛋白、牛血清蛋白为底物时,Km值分别为12.48、14.77、20.05?mg/mL,对米渣蛋白和酪蛋白的催化效率相对较高。M. anka酸性蛋白酶可能在米渣蛋白发酵降解中发挥积极作用。     

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

研究分离纯化发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶(cell envelope proteinase,CEP)的方法及其酶学性质。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)悬浮菌体,进行超声波破碎,细胞质量浓度为0.06g/mL,破碎功率330W,工作220次(工作时间3s,间隔时间5s),离心取上清液即为粗酶液。60%硫酸铵沉淀,Sephacryl S-300 HR凝胶层析,Native-PAGE割胶回收纯化发酵乳杆菌的CEP。用纯化的CEP 酶解脱脂乳,酶解液ACE(angiotensin I-converting enzyme)抑制率为50%。SDS-PAGE检测CEP分子质量为32.5kD,最适酶反应温度为41℃,最适酶反应pH值为8.0。Mg2+、Co2+、Ca2+对CEP活性有激活作用;Zn2+、Ni2+、PMSF、EDTA对CEP活性有抑制作用,说明CEP为丝氨酸蛋白酶且酶的活性中心结构的维持与金属离子有关。     

生姜蛋白酶的分离纯化

生姜蛋白酶能够特异地水解P2位置是脯氨酸(Pro)的肽和蛋白质,这种对Pro的特异性使生姜蛋白酶成为一种非常有前途的用于蛋白质测序和蛋白质中稳定结构域识别的工具酶。中国传统食品“姜撞奶”采用姜汁作为凝乳剂,其中的凝乳因子已被证明是生姜蛋白酶。生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生产中小牛皱胃酶的替代品。此外,生姜蛋白酶在工业上还有更广阔的应用前景。本研究针对生姜蛋白酶的特点,制订一套简便有效的纯化方案,为进一步的基础研究和应用研究提供合格的样品酶。经过实验确立了以下纯化方案:将生姜制成丙酮粉,然后用20倍(W/V)0.1mol/L,pH8.0的磷酸缓冲液提取;上清液加硫酸铵至40%饱和度,其间控制pH>7.0,离心弃去沉淀,上清液继续加硫酸铵至80%饱和度,离心,取沉淀;将沉淀先对0.1mol/L的氨水透析2h,然后对蒸馏水透析至无SO42-检出,最后对层析初始缓冲液进行延长透析至内外离子强度相等;上DEAE-纤维素DE-52柱;层析初始缓冲液为0.01mol/L,pH8.0Tris(含0.5mmol/LDTT,0.2mol/LNaCl),0.05～1mol/LNaCl梯度洗脱,柱1.55.0cm,流速0.75cm3/min,收集速度3ml/管,收集酶活峰,得到在SDS-PAGE上表现为一条带的样品C1和C2。     

地衣芽孢杆菌2709 蛋白酶分离纯化研究

对产自地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)2709 的碱性蛋白酶通过乙醇沉淀、盐析、DEAE 阴离子交换层析、凝胶层析4 步纯化,最终获得电泳纯的酶。以去酰胺度及酶比活力为指标,对碱性蛋白酶分离纯化条件进行优化。结果发现：提纯酶的比活力达61069U/mg,纯化倍数为38.7,活性回收率为19.3%,去酰胺度为20.9%。并研究该酶的基本酶学特性,结果发现：该酶最适作用pH 值为10.0,最适反应温度为50℃。40℃保温2h 后该酶保持80% 以上的活力,在pH8～11 之间有较高的pH 值稳定性。     

巴西松子中蛋白酶的分离纯化及酶学性质

在单因素试验基础上,通过正交试验研究pH值、提取时间和料液比3个因素对巴西松子中蛋白酶活力的影响,得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取缓冲液为pH9.0的硼酸-硼砂缓冲液、提取时间为60min、料液比为1:8(m/V);采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析分离纯化巴西松子中的一种蛋白酶,结果表明:纯化后蛋白酶比活力提高到了8.61倍,回收率为21.65%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明:该蛋白酶分子质量为33kD。酶学性质结果表明:该蛋白酶最适pH值为9.0,属碱性蛋白酶;反应的最适温度为50℃;金属离子Mn2+对该蛋白酶活性有强烈的激活作用,而Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用。     

Purification and Some Properties of a Protease from Sorghum Malt Variety KSV8–11

A protease from sorghum malt variety KSV8–11 was purified by a combination of dialysis against 4 M sucrose, ion‐exchange chromatography on Q‐Sepharose (Fast flow), gel filtration chromatography on Sephadex G‐100 and hydrophobic interaction chromatography on Phenyl Sepharose CL‐4B. The enzyme was purified 5‐fold to give a 14.1% yield relative to the total activity in the crude extract and a final specific activity of 1348.9 U mg^?1 protein. SDS‐PAGE revealed a single migrating protein band corresponding to a relative molecular mass of 16 KDa. Using casein as substrate, the purified protease had optimal activity at 50°C and maximal temperature stability between 30°C and 40°C but retained over 64% of its original activity after incubation at 60°C for 30 min. The pH optimum was 5.0 with maximum stability at pH 6.0 but 60% of the activity remained after 24 h between pH 5.0 and 8.0. The protease was inhibited by Ag⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, iodoacetic acid (IAA) and p‐chloromercuribenzoate (p‐CMB), stimulated by Cu²⁺, Sr²⁺, phenylmethylsulfonyl‐fluoride (PMSF) and 2‐mercaptoethanol (2‐ME) while Mn²⁺ and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) had no effect. The purified enzyme had a K_m of 18 mg·mL^?1 and a V_max of 11.1 μmol · mL^?1 · min^?1 with casein as substrate.