高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白含量

建立婴幼儿配方乳粉中A1、A2 β-酪蛋白的高效液相色谱-串联质谱测定方法。乳粉经尿素溶液溶解稀释,胰蛋白酶酶解,过膜后利用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱分离,0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱,高效液相色谱-串联质谱仪测定。结果表明,A1、A2 β-酪蛋白在0.02～2.00 mg·mL^-1线性范围内,相关系数(R²)均≤0.99,检出限为0.05～0.10 g·kg^-1;定量限为0.2～0.5 g·kg^-1;平均回收率在92.08%～105.29%;平均相对标准偏差为1.5%～7.9%。随机选取了10个品牌的婴幼儿配方乳粉进行测定,得到A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白的含量在0～30.3 g·kg^-1。     

A1/A2型β-酪蛋白检测方法研究进展

乳中最常见的β-酪蛋白主要分为A1型和A2型。A2型为原始β-酪蛋白，而A1型等变异体是源于DNA突变所导致的氨基酸序列发生变化。由于A1 β-酪蛋白基因型的个体牛具有较高的产奶量，因此在不断选育后产生了大量的A1型等变异体。但研究表明，A2 β-酪蛋白比A1 β-酪蛋白表现出更好的生物活性。目前已开发出了各种A2奶类产品，但其中的A1/A2型β-酪蛋白的检测方法还未标准化。就目前常见的A2 β-酪蛋白的检测方法进行了分类阐述总结，分别从分子、蛋白质水平以及代谢物差异等方面检测A2 β-酪蛋白或检测A2奶中是否存在A1 β-酪蛋白。这对未来创新、改进检测A2 β-酪蛋白的方法以及建立乳制品中A2 β-酪蛋白检测及定量分析提供理论参考，以期更好的便携式现场检测方法标准化地应用于现实。     

A2β-酪蛋白的功能性及其在乳制品中应用的研究进展

牛奶中富含多种营养成分,包括蛋白质、脂质、碳水化合物等,每100 g牛奶中就含有3 g蛋白质,其中主要包括乳清蛋白和酪蛋白。β-酪蛋白占牛奶蛋白总量的24%～28%,其主要包括两种基因型：A1型与A2型。A1β酪蛋白经消化后产生的β-酪啡肽-7会导致人体消化功能紊乱、心血管疾病等不良反应。A2β-酪蛋白则产生较少甚至并不产生β-酪啡肽-7,在胃肠道消化、提高抗氧化功能、降低胆固醇浓度等方面具有益生作用。本文综述了β-酪蛋白基因型在人体内消化后所产生的影响,并阐述了A2β-酪蛋白的益生功能,讨论其对人体健康的作用。并从β-酪蛋白基因型在乳制品中的应用入手,阐述A2β-酪蛋白乳制品的研究进展,为今后乳制品中A2β-酪蛋白的功能研究提供指导意义。     

响应曲面法优化β-酪蛋白及其A1、A2型变异体检测方法的酶解条件

利用响应曲面法优化β-酪蛋白及其A1、A2型变异体超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法的酶解条件。将酶解设备（X1）、酶解时间（X2）和酶加入量（X3）作为影响因子，以A2型β-酪蛋白(Y1)、A1型β-酪蛋白(Y2)和β-酪蛋白总量（Y3）的质量浓度为评价指标。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，针对检测方法中酶解反应这一关键步骤，通过单因素实验优选，响应曲面法研究酶解时间（X2）和酶加入量（X3）与A2型β-酪蛋白(Y1)、A1型β-酪蛋白(Y2)和β-酪蛋白总量（Y3）之间的关系。确定最佳酶解条件为：酶解设备（X1）为水浴摇床，酶解时间（X2）为2.5 h，酶加入量（X3）为15μL。     

A1与A2β-酪蛋白酸奶产品特性的比较

探究分别含有A1、A2两种β-酪蛋白牛乳制成的搅拌型和凝固型酸奶产品特性的区别。持水力结果表明,A1β-酪蛋白酸奶（凝固型和搅拌型）的持水力大于69%,A2β-酪蛋白酸奶（凝固型和搅拌型）的持水力大于65%。质构特性的结果显示,凝固型酸奶差距更为明显,A1 β-酪蛋白酸奶的硬度和稠度分别比A2 β-酪蛋白酸奶高41.4%和59.8%。此外,A1 β-酪蛋白酸奶黏性优于A2 β-酪蛋白酸奶。流变学特性与微观结构结果显示,A1 β-酪蛋白酸奶的滞后回路面积较A2 β-酪蛋白酸奶小14.6%,说明A2 β-酪蛋白制成的酸奶结构更易于被破坏,网状结构更为稀疏。本实验为A2 β-酪蛋白牛乳在酸奶制品的应用及实际生产提供一定理论支持。     

液相色谱-高分辨串联质谱法测定奶粉中A2β-酪蛋白及β-酪蛋白与乳清蛋白含量关系的研究

目的:建立奶粉中A2β-酪蛋白分离定量的液相色谱-高分辨串联质谱法,并利用婴儿配方奶粉中酪蛋白、乳清蛋白和总蛋白含量的关系,间接得到乳清蛋白含量。方法:样品经前处理后,采用ACQUITY UPLC HSS T_(3)柱(100 mm×2.1 mm×1.8μm),0.1%甲酸-水和乙腈为流动相,梯度洗脱分离。多反应离子监测模式定量测定其中的A2β-酪蛋白特征肽。结果:在0.02~2.0μmol/L范围内线性关系良好(r=0.9938)。在低、中、高三水平加标试验中,回收率在94.9%~98.7%,相对标准偏差在1.7%~3.7%,检出限为0.80 mg/100 g,可满足对奶粉中A2β-酪蛋白定量要求。采用该法对市售11批声称A2奶粉和18批未声称A2奶粉(以下简称A2奶粉和普通奶粉)中A2β-酪蛋白进行测定。结论:A2奶粉中A2β-酪蛋白占总β-酪蛋白含量的86.2%~98.7%,而普通奶粉则低至20.0%~50.0%。另外,乳清蛋白含量的间接测定值和理论计算值经统计分析,无明显差异(P>0.05),为分析婴儿配方奶粉中乳清蛋白含量是否符合国标要求提供参考。     

基于特征肽段结合超高效液相色谱-串联质谱法的乳制品真实性鉴别方法研究

目的 基于超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)建立乳制品中乳铁蛋白、乳桥蛋白、奶牛A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白、水牛A2 β-酪蛋白的检测方法, 开展市售乳制品中功能性蛋白质检测和乳制品真实性鉴评分析。方法 乳蛋白经酶解后, 应用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole-Orbitrap high resolution mass spectrometry, UPLC-Q/Orbitrap HRMS)和UPLC-MS/MS筛选获得可用于定性定量分析的特征肽段, 基于UPLC-MS/MS建立同时检测LF、LPN、奶牛A1 β-CN、奶牛A2 β-CN和水牛A2 β-CN的方法并应用于乳制品检测。结果 5种待测蛋白在相应的浓度范围内线性关系良好(r2>0.99), 加标回收率在82.1%~105.5%之间, 相对标准偏差均小于5%, 78份乳制品的检测结果表明同类样品LF含量差异较大,不同类液体乳中LPN均值差异不大。结论 本方法性能良好, 适用于乳制品中乳桥蛋白等功能性蛋白的同时检测, 也可以实现乳制品中乳蛋白物种来源的鉴别。     

高原娟姗牛β-酪蛋白A2纯合基因型的筛选鉴定

为了筛选出A2A2基因型娟姗牛，组建A2型奶牛育种核心群，为A2牛奶的开发应用奠定基础。从云南欧亚乳业公司鹤庆有机牧场核心群选取385头娟姗牛进行尾静脉采血，提取血液中基因组DNA，检测浓度和纯度后，将提取的DNA进行PCR扩增并送公司测序，同时对血清中β-酪蛋白的含量进行检测。经不同公司各自使用不同引物进行检测，结果一致。在所有娟姗牛中，检测到3种基因型：A2A2基因型198头、A1A1基因型29头、A1A2基因型158头；3种基因型奶牛分别占51.43%、7.53%和41.04%,A2基因频率达71.95%。娟姗牛β-酪蛋白的平均含量为5.58μg/mL,A2A2型和A1A2型奶牛的β-酪蛋白含量均显著低于A1A1型奶牛（P<0.05），但是A2A2型和A1A2型奶牛之间则无统计学差异（P>0.05）。结果表明，通过DNA测序检测突变位点核苷酸能够鉴定出A2A2基因型娟姗牛，β-酪蛋白含量测定不能分辨出A2A2型和A1A2型娟姗牛。与ELISA蛋白检测方法相比，DNA测序法具有快速准确、成本较低等优点，可作为牛群分型的理想方法。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中双酚A

目的通过优化牛奶中双酚A提取纯化和测定条件,建立牛奶中双酚A(bisphenol A,BPA)的超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)定量检测方法。方法 采用乙腈作为提取剂和蛋白质沉淀剂,混合型阴离子固相萃取柱净化,采用UPLC-MS/MS在负离子模式下检测,内标法定量。结果该方法在1~100μg/L范围内有良好的线性关系,相关系数r20.990,在空白牛奶基质中,不同添加水平下方法的平均回收率范围为92%~115%,相对标准偏差为3.7%~6.6%;测定低限为1μg/kg。结论 此方法灵敏度高、准确、重现性好,适用于牛奶样品中双酚A的检测。     

羊乳婴幼儿配方粉中牛乳成分鉴别与测定模型的建立

目的 基于超高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)建立羊乳婴幼儿配方粉中牛乳的鉴别与测定模型,实现羊乳婴幼儿配方粉中牛乳成分的快速分析。方法 样品经胰蛋白酶水解,采用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry, Q-Orbitrap-HRMS)结合蛋白数据库筛选特征肽段。选择具有代表性的羊全脂乳粉、牛全脂乳粉、羊乳清粉、牛乳清粉,分别按不同的比例进行混合, UPLC-MS/MS测定,通过换算系数构建特征肽与牛全脂奶粉和牛乳清粉的鉴别和定量分析模型。结果 牛β-酪蛋白与牛全脂奶粉的换算系数k₁为2.8343,牛β-乳球蛋白与牛全脂奶粉的换算系数k₂为1.6542,牛β-乳球蛋白与牛乳清粉的换算系数k₃为27.8598。牛β-乳球蛋白和牛β-酪蛋白在20～1000 nmol/L范围内,线性关系...     

牛乳β-酪蛋白检测的间接ELISA方法

将从干酪素中提取的牛β-酪蛋白对新西兰白兔进行多次皮下免疫注射.采集血清并用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,以制备兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.最后将纯化的抗体用于间接ELISA法检测牛乳β-酪蛋白的含量.     

柑橘纤维添加量对搅拌型A2β-酪蛋白酸奶品质的影响

目的：研究不同柑橘纤维添加量对搅拌型A2β-酪蛋白酸奶品质的影响。方法：以酸奶酸度、粘度、持水力、脱水收缩敏感性和稳定性指数为指标,研究不同柑橘纤维添加量（0‰、0.3‰、0.5‰、0.7‰、0.9‰）对搅拌型A2β-酪蛋白酸奶的影响。结果：随着柑橘纤维添加量的增加,酸奶的酸度、粘度、持水力、脱水收缩敏感性和稳定性指数均发生变化,当柑橘纤维添加量为0.5‰时,产品酸度适中,粘度、持水力、脱水收缩敏感性较好,产品组织结构更稳定。结论：使用柑橘纤维作为稳定体系的原料,工厂产业化生产搅拌型A2β-酪蛋白酸奶时,柑橘纤维添加量至少应为0.5‰。     

同位素稀释质谱法测定乳及含乳饮料中的酪蛋白含量

目的建立同位素稀释质谱法对以牛乳、乳粉为原料的饮料中4种不同亚型的酪蛋白进行含量测定。方法样品溶解后,经等电点沉淀法提取其中的酪蛋白,将样品复溶液稀释至适当浓度,取适量稀释液同时混入多肽同位素内标,加入胰蛋白酶酶解16 h,使用甲酸停止酶解反应,定容后离心,取上清液分析;以WATERS ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm,1.8μm)作分析柱,用0.3%(V:V)甲酸-水和乙腈作为流动相,梯度洗脱分离。质谱采用ESI正离子模式检测,多反应监测模式进行采集,内标法定量分析。结果 4种不同亚型的酪蛋白特征肽段在4 min内达到基线分离,αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白在0.05~8μmol/L浓度范围内线性良好,αs2-酪蛋白在0.01~5μmol/L浓度范围内线性良好,相关系数均在0.9990以上。αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的方法检出限均为3 nmol/L,定量限均为10 nmol/L,αs2-酪蛋白的方法检出限为1.6 nmol/L,定量限为5 nmol/L。阴性基质加标的复溶液中,β-酪蛋白浓度在0.5、2.0、5.0μmol/L 3个水平下的平均回收率为62.21%~84.36%,相对标准偏差为3.37%~5.50%。采用该方法分别测定了豆奶粉、白咖啡饮品和液体乳饮料中的酪蛋白含量,结果表明3种样品中均含有4种不同亚型的酪蛋白,且含量各不相同。结论该方法灵敏度高、特异性强,可以准确快速地测定乳及含乳饮料中酪蛋白含量。     

高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

建立一种同位素稀释-高效液相色谱-串联质谱法定量检测婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,CPPs）含量的方法。经Q Exactive Orbitrap扫描,Uniprot蛋白质数据库初步确定CPPs所含肽段,根据质谱响应以及加标回收率等方法学验证实验进一步筛选确定CPPs的特征肽段。样品经过前处理后,采用ACQUITY UPLC BEH 300 C18色谱柱分离,多反应离子监测模式定量测定其中的CPPs特征肽。根据CPPs原料与CPPs特征肽含量的折算系数,从而确定出样品中CPPs的含量。方法学验证结果表明,所建立的方法在10～150?mg/100?g范围内线性关系良好,相关系数大于0.999。在高、中、低3?水平加标实验中,回收率在96.2%～100.2%之间,日间重复性在5.3%～7.8%之间。方法定量限为1?mg/100?g,可以满足婴幼儿配方奶粉中不同CPPs含量水平的定量要求。     

低温微滤技术制备富含β-酪蛋白和乳清蛋白的新型功能性乳蛋白配料

以市售的巴氏杀菌脱脂乳为原料,探究膜孔径、温度、洗滤液和洗滤次数等条件对β-酪蛋白和乳清蛋白分离效果和膜通量的影响,最终制备了富含β-酪蛋白与乳清蛋白的新型功能性乳蛋白配料。研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱对蛋白做定性和定量分析。研究表明,在4℃条件下,使用30 nm孔径的陶瓷膜,以水作为洗滤液,可使得β-酪蛋白的分离效果最佳;在最优条件下,脱脂乳经微滤浓缩3倍后,再在相同条件下补水洗滤4次,将膜过滤各阶段所得的透过液混合,可得到β-酪蛋白和乳清蛋白的产率分别为51.7%和99.7%,复合蛋白中β-酪蛋白和乳清蛋白所占比例分别为51.1%和40.0%,而αs-酪蛋白的含量得以大大降低,该功能性复合蛋白可作为一种新型的功能性蛋白配料用于配方乳粉等婴幼儿食品的研制。     

山羊β-酪蛋白的分离及其含量的测定

从呼和浩特市周边地区采集的新鲜山羊奶，通过离心脱脂，调节等电点沉淀蛋白，对所得沉淀物进行DEAE离子交换层析，分离出α-酪蛋白和β-酪蛋白，并且β-酪蛋白被完全纯化出来。建立ELIsA双夹心方法对β-酪蛋白的含量进行测定，该法可直接用于培养液中β-酪蛋白的定量分析。     

牛乳β-乳球蛋白变异体检测方法研究进展

β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳中重要的天然活性营养物质,也是牛乳中主要的过敏原之一。β-乳球蛋白约为乳清蛋白总量的50%,是牛乳中主要的乳清蛋白,具有较强的热敏感性和致敏性,在优质乳品工业中起关键作用。其不仅作为牛奶热处理强度的评估指标,还作为食品中牛乳过敏原的标志蛋白,有效识别和检测牛乳β-乳球蛋白非常重要。已报道的牛乳β-乳球蛋白有13种变异体,其中A和B是牛乳β-LG的常见变异体,且含量最高。根据不同的检测原理,文章简述近年来牛乳β-乳球蛋白变异体的三大类检测方法,总结电泳法、色谱法和免疫法的原理、优缺点及部分应用实例,重点介绍液相色谱法和毛细管电泳法两种定量方法,并展望牛乳β-乳球蛋白未来的发展方向。     

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的 基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplificationrefractorymutationsystempolymerase chain reaction, ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法 本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果 本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L; 10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论 本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。     

香菇素与β-酪蛋白的相互作用研究

目的 研究β-酪蛋白与风味物质香菇素相互作用的具体机制, 阐明相互作用对β-酪蛋白结构及微环境产生的影响。方法 构建香菇素-β-酪蛋白互作模型体系, 经荧光光谱法、紫外-可见分光光度法、圆二色光谱、等温滴定及气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法对香菇素与β-酪蛋白的相互作用进行检测分析。结果 气相色谱-质谱法检测结果表明, β-酪蛋白对香菇素起到显著缓释的作用, 光谱法检测结果及等温滴定结果表明, β-酪蛋白和香菇素的结合主要由疏水相互作用驱动, 热量变化焓值(ΔH)为7.25 kJ/mol, 熵值(ΔS)为113.20 J/(mol·K)。结论 香菇素与β-酪蛋白发生了疏水相互作用。在相互作用过程中, β-酪蛋白发生了静态荧光淬灭, 紫外光谱蓝移以及β-酪蛋白甲基化位点的改变证明了相互作用影响了β-酪蛋白的结构以及微环境极性。     

婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽2种检测方法的比较

目的比较婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPPs)的2种主要检测方法。方法分别采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)和高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)检测婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽的含量。结果 HPLC操作简便,检出限为7.5mg/100g,日内精密度≤2.7%,满足婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽的检测要求;而HPLC-MS/MS检出限为1mg/100 g,日内精密度≤8.8%,较HPLC具有更好的灵敏度。结论 HPLC高效准确,实验操作简单,适合于CPPs含量较高样品的检测分析;HPLC-MS/MS灵敏度高、特异性强,适用于CPPs含量较低样品的检测。