表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因重组鸡痘病毒的构建与鉴定

目的构建表达猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组鸡痘病毒。方法将PCV2ORF2基因插入到转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTA-ORF2,将该质粒与鸡痘病毒野生株282-E4共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。经BrdU加压筛选重组鸡痘病毒,采用RT-PCR和间接免疫荧光法进行鉴定。结果重组鸡痘病毒感染的CEF经RT-PCR可扩增出260bp的目的基因,间接免疫荧光检测可见特异性黄绿色荧光,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建了1株表达PCV2ORF2基因的重组鸡痘病毒。     

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。     

HIV-1 env基因在重组鸡痘病毒中的表达

在以鸡痘病毒复制非必需区TK基因为侧翼构建的载体 (插入有 16个串联的突变型痘苗病毒P7 5启动子和牛痘病毒A型包涵体晚期启动子及LacZ报告基因 )中的复合启动子下游 ,分别插入编码人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型外膜蛋白的env基因和中国株HIV 1gp12 0基因 ,通过与野生型鸡痘病毒的同源重组 ,X gal显色挑斑 ,获得 2株重组病毒vUTA - 2f- 16LE和vUTA - 2f- 16LG。经Dot-ELISA、免疫荧光试验、SDS -PAGE和Westernblot检测表明 ,2株重组病毒均能表达gp16 0和gp12 0 ,相对分子质量分别为 16 0 0 0 0和 12 0 0 0 0。经小鼠免疫试验其血清中抗gp12 0抗体A值和脾脏CD4+ /CD8+ T淋巴细胞比值均高于对照组 (P <0 .0 1) ,说明由重组病毒表达的Env蛋白和Gp12 0蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。     

中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体,表达ＨＩＶ－１　Ｇａｇ蛋白,进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼,插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游,插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因（Ｂ亚型）,构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞,进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选,Ｘ－ｇａｌ染色,获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ,用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果　经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测,重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００,为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论　所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。     

二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗的豚鼠免疫试验

目的检测携带口蹄疫病毒(FMDV)Asia-1型P1-2A-IL18基因和O型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒疫苗诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力。方法将重组鸡痘病毒vUTAL-P1-2A-IL18-P1-2A-3C、w-FPV和PBS分别经肌肉注射免疫豚鼠,检测豚鼠脾T淋巴细胞亚群数量、特异性CTL细胞杀伤活性和血清中抗FMDV特异性抗体水平。结果重组鸡痘病毒免疫豚鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群数量和特异性CTL细胞杀伤活性均显著高于w-FPV和PBS对照组,且能产生抗O型和Asia-I型FMDV特异性抗体。结论二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗能诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

表达PRRSV GP5、GP3和猪IL-18的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的研制安全有效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法将PRRSV长春株的GP5和GP3基因插入到含有猪IL-18基因的鸡痘病毒转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL-IL-18-GP5-GP3。将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过3次BrdU加压筛选,经PCR、RT-PCR和IFA方法鉴定重组病毒。结果从重组鸡痘病毒基因组和总RNA中扩增出340bp的目的基因片段,感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建1株重组鸡痘病毒,并可正确表达PRRSVORF5/ORF3基因。     

传染性喉气管炎病毒gD基因重组禽痘病毒的制备、纯化及初步鉴定

目的制备传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD基因重组禽痘病毒,并进行纯化及初步鉴定。方法将含有ILTV河南长葛株gD基因的禽痘病毒转移载体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞,采用蓝色蚀斑筛选纯化重组禽痘病毒,并经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)进行鉴定。结果经过5轮蚀斑筛选纯化,获得1株重组禽痘病毒rFPV-ILTV-gD,其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见约1400bp的ILTVgD特异性条带。IFA检测显示重组禽痘病毒中的ILTVgD基因得到了表达。结论已成功制备并纯化了ILTVgD基因重组禽痘病毒,为预防ILT提供了新的途径。     

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建

目的构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU3次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。     

鸡痘病毒在鸽体内的分布及毒性

目的检测鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)在鸽体内的分布及毒性。方法将鸡痘病毒经翅膀内侧无血管处刺种鸽子,50μl/只,对照组经相同部位刺种等量生理盐水。刺种后逐日进行临床观察,分别于刺种后6h、12h、1d、3d、7d、10d、15d和21d,剖杀鸽子,进行内脏器官的病理组织学检测,采用PCR法检测FPV在鸽体内的分布。结果在试验期间,幼鸽精神状态良好,采食、饮水正常,刺种后15d,临床症状基本消失;各组织未见明显的病理变化;刺种后6h,在刺种肌肉内检测到病毒DNA;刺种后3d和7d,在所有组织内均检测到病毒DNA;刺种后10d,在肌肉和脾脏内可检测到病毒DNA;刺种后15d,所有组织内均未检测到病毒DNA;对照组未检测到病毒DNA。结论鸡痘病毒在鸽体内存留时间短,无毒性,生物安全性良好。     

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

HIV-1 Gag蛋白在重组痘苗病毒中的高效表达及其特性分析

在构建3株人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV－1）Gag基因重组痘苗病毒的基础上,实现了Gag蛋白的高效表达,3株重组病毒在感染细胞中表达量分别为14．7、6．0和4.5μg／106细胞／20h,接近杆状病毒的表达水平。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（VLP）,并可诱导小鼠产生抗HIV抗体。