随机光学重构显微术及其应用研究进展

在光学显微成像领域,涌现出一批可以突破衍射极限的超分辨显微成像技术,极大地增强了人们研究亚细胞结构的能力。基于单分子定位技术的随机光学重构显微术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM）具有易懂的成像原理、简单的工作方式以及超高的分辨率等特点,受到越来越多的研究者青睐。首先,介绍了单分子定位技术的原理,讨论了STORM光路的搭建,阐述了二维和三维STORM超分辨显微成像原理。其次,探讨了多色STORM以及STORM与电镜关联成像现状。最后介绍了STORM技术现阶段的应用进展。     

利用受激发射损耗(STED)显微术突破远场衍射极限

远场光学显微镜受衍射极限分辩率的限制，而近场光学显微镜由于缺乏层析能力，则无法实现超分辨的三维成像，研究了既可突破远场光学显微术的衍射极限分辨率又可实现三维成像的成像技术——受激发射损耗（STED），综述了STED的分辨率与STED光的光强，延迟时间、光斑空间分布等主要参数的关系，以及该技术的最新进展和应用前景。     

受激辐射损耗超分辨成像技术研究

受激辐射损耗显微成像(STED)是一种超分辨荧光显微成像技术,它能够突破传统光学衍射极限的限制,把远场光学分辨率提高到百纳米以内,被广泛应用于生物医学等领域,是目前光学显微成像领域研究的热点之一。采用了一种基于超连续谱皮秒脉冲白激光光源的STED显微系统,实现超分辨成像。并从精密合束、脉冲延迟和损耗光残留光强几个方面探讨系统优化,从而获得最佳的成像效果。对直径约25 nm荧光微球成像实验的数据表明:该系统成像分辨率可达约60 nm,分辨能力远远高于衍射极限。另外,系统成功实现了对核孔复合物、微管和微丝等一系列生物样品的超分辨成像,共聚焦成像中某些模糊不清的结构在STED成像中清晰可辨。     

超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展

细胞是生命体的基本单位和功能单位,对活细胞内部结构及其功能的研究是了解掌握生命本质的基础之一,因此活细胞的实时观测对生命科学的发展具有重要意义。传统的光学显微技术受衍射极限的限制,无法观测200 nm以下的生物结构细节。近20年来,随着超衍射极限光学理论、技术、器件和荧光探针等方面的快速发展,超分辨显微成像技术已成为应用于生命科学研究的重要手段。然而,大多数超分辨显微方法或测量耗时长,或易引起荧光蛋白漂白/细胞损伤,在活细胞研究中受到极大限制,已成为超分辨显微领域重点攻关的方向之一。为此,文中结合作者在快速超分辨显微技术研究的基础上,介绍了基于单分子成像的光激活定位显微技术和随机光学重构显微技术、基于荧光非线性可饱和光转换的受激发射显微技术以及基于结构光照明的超分辨显微技术,并探讨了在活细胞成像中的发展应用。最后,文中展望了超分辨显微成像技术在活细胞成像中的未来发展趋势。     

超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用（特邀）

观察细胞器间动态相互作用,深入分析作用规律,对于揭示生理病理过程现象背后的机制具有十分重要的意义。传统光学显微镜受到由光波波长和孔径造成的衍射极限的限制,无法观测细胞器纳米级精细结构及细胞器间相互作用的动态变化规律。超分辨显微成像技术的出现为细胞器相互作用研究提供了重要手段,在深入揭示细胞器相互作用规律,阐明生理病理现象深层的机制研究中发挥了重要的作用。文中介绍了受激发射损耗（Stimulated emission depletion, STED）显微成像、结构光照明显微成像（Structured illumination microscopy, SIM）、单分子定位显微成像（Single molecule localization microscopy, SMLM）技术,并总结了这三类超分辨显微成像技术在细胞器相互作用中的应用与现状,为超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用提供思路拓展。最后,对超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的优势与不足进行分析总结,展望了超分辨显微成像技术在活细胞内细胞器相互作用成像中的需求发展趋势,为光学与医学及生物学的交叉融合发展提供一定的参考。     

超分辨荧光显微镜中的解卷积技术及应用（特邀）

超分辨荧光显微镜突破了光学衍射极限造成的空间分辨率限制,使得生物学家能够在生命体和细胞具有活性的状态下,对其功能与结构进行高精度动态记录,有望揭示更多重要的生命现象细节。然而,由于超分辨荧光显微技术的成像视场、深度、分辨率、速度等不易兼得,所以解卷积作为一种最有效且直接的求解逆问题的框架,被广泛应用于增强超分辨显微镜的时空分辨率。研究人员聚焦于通过相应算法设计实现高质量显微图像的重建,在一定程度上克服了超分辨荧光显微镜的硬件限制,可以更好地恢复生物信息。本文首先介绍了解卷积方法的基本原理及其发展历程,接着列举了不同解卷积技术在不同模态下的重建原理和效果以及这些技术在生物学上的应用,最后总结了基于深度学习的解卷积方法在超分辨荧光显微镜技术上的最新进展和未来的发展潜力,并对包括傅里叶环相关的定量评估图像重建质量的方法的最新进展进行了阐述。     

亚20nm荧光超分辨显微技术研究进展（特邀）

荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来,经历了多代创新与发展,其空间分辨率已经远超衍射极限,横向分辨率能够达20 nm以下,可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术,并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外,针对分辨率的限制因素,就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨,并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。     

基于结构照明的超分辨荧光显微成像重建算法

由于具有低光毒性、高速宽视场以及多通道三维超分辨成像能力,超分辨结构照明显微术(SR-SIM)特别适合用于活细胞中动态精细结构的实时检测研究。超分辨结构照明显微图像重建算法(SIM-RA)对SR-SIM的成像质量具有决定性影响。本文首先简要介绍了超分辨显微术的发展现状,阐述了研究SR-SIM图像重建算法的必要性;然后介绍了SR-SIM的成像原理,并重点介绍了SR-SIM图像重建算法,包括SR-SIM中频繁使用的去卷积重建算法、SR-SIM校准与重建过程中参数值获取的算法,以及目前发展的超分辨结构照明显微图像重建算法,并介绍了SR-SIM工具箱;最后总结了当前发展超分辨结构照明显微图像重建算法需解决的5个问题。     

单分子三维取向超分辨成像技术进展（特邀）

超分辨显微成像技术自诞生以来,凭借其优异的纳米级空间分辨率,已成为生命科学研究中精准揭示复杂生命现象的重要成像技术。其中,基于单分子定位的超分辨成像策略,使得定位、观察、研究单个探针分子独特的理、化、光学性能成为可能。偏振作为荧光信号的一个重要特性,近年来伴随着单分子三维取向成像技术的发展,逐步在单分子成像和超分辨领域中展示出诸多新颖且重要的应用特性。本文总结了单分子三维取向超分辨成像技术的最新进展,介绍并分析了两类主要的单分子三维取向荧光显微技术——基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法以及利用点扩散函数工程将单个荧光分子的三维取向信息编码到荧光图像上的成像策略。此外,还探讨了应用于活细胞或单颗粒的其他类型的超分辨取向成像技术。最后,针对单分子三维取向超分辨成像技术发展与应用前景面临的挑战,进行了总结与展望。     

基于荧光随机涨落的超分辨显微成像

基于荧光随机涨落的超分辨显微成像技术具有成像速度快、空间分辨率高、系统成本低和光毒性小的成像优势,在对生物亚细胞结构及其动态运动过程的成像和监测中具有广阔的应用前景。近年来,基于荧光发射的间歇性,发展出多种图像重建算法实现荧光涨落超分辨成像,在无须对传统的荧光显微镜做任何硬件改造的情况下,显著提升了光学成像的空间分辨率,实现了突破光学衍射极限的超分辨成像。从重建算法、成像速度、分辨率提升和图像重建质量等方面,对比分析不同类型荧光涨落超分辨方法的差异和适用范围,为生命科学研究人员针对特定的生物学问题选择最佳的超分辨方法提供参考依据。