高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选及其对酱香型白酒堆积过程的影响

为提高和稳定白酒中四甲基吡嗪含量,本研究从酱香大曲样品中分离出13株芽孢杆菌,通过蛋白酶透明圈试验初筛,选出5株产蛋白酶优良菌株。经过液态发酵试验筛选出一株高产四甲基吡嗪的功能菌,其发酵液中的四甲基吡嗪含量为12.22 mg/L,鉴定为地衣芽孢杆菌GTBL-168。将该菌株的种子培养液按0%、3%、5%和7%（v/w）接种到酱香型白酒堆积培养中与传统大曲协同发酵,堆积糟醅中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量均有提高,其中接种量为7%时增量最大,四甲基吡嗪产量比对照组提高24.88%;理化指标总体变化较明显,氨基氮和总酸有所增加;地衣芽孢杆菌GTBL-168的添加对堆积糟醅的菌群结构影响不大,随着接种量的增加糟醅中芽孢杆菌属等各优势菌属丰度也随之增加。为功能菌在堆积过程中的应用研究奠定了基础。     

酱香大曲中高产四甲基吡嗪微生物的选育及应用研究

为了选育得到高产四甲基吡嗪的功能微生物以提高酱香白酒中四甲基吡嗪含量,本研究采用富集培养、Voges-Proskauer(V-P)反应实验、蛋白酶透明圈实验结合发酵实验从酱香大曲中筛选得到乙偶姻、蛋白酶和四甲基吡嗪产量高的微生物,并将其应用于酱香大曲模拟生产。经过V-P反应实验和蛋白酶透明圈实验从富集培养得到的微生物中初筛到6株高产乙偶姻和蛋白酶的微生物,再经发酵实验进一步筛选到1株四甲基吡嗪产量表现优异的微生物△JYF1,达到424 mg/L,对其进行形态学观察和分子生物学鉴定确定为西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。菌株△JYF1应用于酱香大曲模拟生产时,发酵产物中四甲基吡嗪产量可以达到65.51 mg/kg,还具有浓郁的酱香味。     

产乙偶姻菌株的分离鉴定及其对固态混菌发酵产物的影响

乙偶姻（ACT）是白酒中重要功能物质四甲基吡嗪（TTMP）的关键前体物,该研究从酱香型大曲中筛选分离产乙偶姻菌株,结合形态学观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并将其应用于固态混菌发酵,考察其对发酵产物理化指标、有机酸及挥发性风味物质的影响。结果表明,分离筛选出一株产乙偶姻菌株A12F＿C118,经鉴定其为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）。添加菌株A12F＿C118混菌发酵产物中,水分、还原糖、总酸、pH值分别比空白组分别提高了39.40%、38.46%、127.63%、11.93%;添加菌株A12F＿C118混菌发酵产物中共检出挥发性风味物质51种,其中正戊醇、苯乙酸乙酯、己酸乙酯、四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪等重要风味物质含量均有所增加。菌株A12F＿C118对固态混菌发酵过程中草酸、L-苹果酸、L-乳酸、乙酸、柠檬酸的合成皆有促进作用,但对琥珀酸的影响不明显。     

高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选及在清香型原酒生产中的应用研究

四甲基吡嗪作为白酒中的重要呈味物质,近年来得到白酒企业的广泛关注。从大曲中分离到11株芽孢杆菌,通过脱脂奶粉平板初筛,发酵复筛,得到了4株高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌。优选的菌株应用于原酒酿造,极大提高了原酒中四甲基吡嗪的含量,大曲酒中四甲基吡嗪含量达到10 mg/L以上。     

高温大曲中产四甲基吡嗪细菌的筛选及鉴定

四甲基吡嗪是中国白酒中的重要香气化合物。该研究从高温大曲中分离纯化获得26株菌株,通过V-P实验初筛,其中10株为四甲基吡嗪前体物3-羟基丁酮高产菌株。进一步通过液态发酵复筛,结合气相-质谱联用（GC-MS）仪分析测定,最终筛选出2株高产四甲基吡嗪的菌株A7和A18,其四甲基吡嗪产量分别为350.98 mg/L、163.49 mg/L。根据菌落形态特征和16S rRNA序列分析,菌株A7和A18分别被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）和蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）。菌株A7发酵产物GC-MS结果显示,吡嗪类化合物相对含量最高,达到了47.05%,其中以四甲基吡嗪为主,相对含量为45.30%。菌株A7和A18均可应用于白酒酿造工艺改进,提升原酒中四甲基吡嗪的含量,增加白酒保健功能。     

白酒中四甲基吡嗪形成机制及相关应用的研究进展

中国白酒历史悠久，随着“健康中国”的提出，消费者对于白酒健康层面的需求愈加显著，越来越多学者开始致力于白酒中四甲基吡嗪的研究。本文从白酒酿造过程中四甲基吡嗪的生成方式和主要积累环节，高产四甲基吡嗪菌株的分离筛选与强化应用以及四甲基吡嗪的检测方法等方面进行综述，总结得出其生成方式主要为生物反应，高温制曲与高温堆积过程为四甲基吡嗪的主要产生环节，高产四甲基吡嗪菌株也多从上述环节分离获得，并应用于强化制曲、强化堆积发酵及多环节联合应用等研究场景。鉴于白酒发酵过程中样品体系的复杂性及含量低的特点，学者们纷纷建立了优化萃取和检测手段，用于四甲基吡嗪的定性与定量分析，旨在提升日常检测精度。     

凉州熏醋酿造过程产乙偶姻酵母菌筛选及其发酵培养基优化

乙偶姻是凉州熏醋特征风味成分四甲基吡嗪的前体。本实验从凉州熏醋发酵料醅中分离获得了一株产乙偶姻酵母菌T8,通过经典鉴定方法结合ITS基因测序的方法,确定其为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。为探明T8菌株生长及代谢产乙偶姻的营养需求,本实验对产乙偶姻酵母菌T8发酵培养基进行了优化,以期为传统食醋酿造工艺现代化改造过程中人工接种增香酵母种子的制备提供培养基。通过研究不同碳源、氮源、无机盐对T8菌株产乙偶姻的影响,确定了发酵培养基的最终组分:葡萄糖60 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏10 g/L,(NH_4)_2HPO_48 g/L,KH_2PO_40.5 g/L,Mg SO_4·7H_2O 0.75 g/L,Mn SO_40.6 g/L。培养基优化后,乙偶姻产量达到15.236 g/L,与初始发酵培养基相比提高了20.65%。人工接种T8菌株种子液所酿食醋中四甲基吡嗪的含量较对照提高了22.1%,增香效果明显,证明H.Uvarum T8菌株可以作为食醋酿造的增香酵母。     

高产四甲基吡嗪的菌株筛选及其麸曲制作工艺优化

为提高酱香型白酒中四甲基吡嗪含量，该研究从高温大曲中筛选高产四甲基吡嗪的菌株，通过形态观察及分子生物学技术对筛选菌株进行菌种鉴定，并将筛选菌株制作成细菌麸曲，结合单因素试验和响应面法对影响麸曲芽孢数量的四个因素：水分含量、接种量、培养时间、培养温度进行优化。结果表明，筛选得到一株高产四甲基吡嗪的菌株B2，经鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株B2麸曲的最佳培养条件为水分含量58%、接种量3.4%、培养时间40 h、培养温度37℃。此优化条件下制得的麸曲芽孢数量为1.21×10¹⁰ CFU/g。固态发酵6 d后四甲基吡嗪产量为0.98 mg/g，表明该麸曲具有一定的产四甲基吡嗪性能。     

中国白酒中四甲基吡嗪的研究进展

四甲基吡嗪是一种具有爆米花、坚果和水果特别香味的风味物质，广泛存在于白酒、豆制品、陈醋中。在中国白酒中，其在酱香型白酒中含量尤为突出。本文综述了四甲基吡嗪的理化性质和白酒中四甲基吡嗪的合成、检测方法，概括了近年来四甲基吡嗪在白酒中的研究进展，旨在为提高中国白酒中四甲基吡嗪含量及分析提供参考。     

凉州熏醋酿造中高产乙偶姻醋酸菌菌株筛选及其发酵条件优化

四甲基吡嗪是传统发酵食品中重要风味物质,而乙偶姻（acetoin,ACT）是其生物合成前体。本实验从凉州熏醋醋醅中分离出了200 株产酸菌株,利用Voges-Proskauer（V-P）显色反应法初筛得到了28 株产乙偶姻的菌株,用火焰离子化检测器结合气相色谱（gas chromatograph-flame ionization detector,GC-FID）法复筛得到了一株高产乙偶姻的菌株C92,经生理生化和16S rRNA鉴定为巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）。在单因素试验基础上使用Design-Expert设计响应面优化试验,得到最佳发酵条件为培养温度31.31 ℃、接种量8.27%、pH 6.55、摇床转速209 r/min,此条件下乙偶姻产量最大,达到19.04 g/L,比原始发酵产量高35.8%,证明C92菌株是一株在食醋酿造过程中具有潜在应用价值的菌株。     

山西老陈醋酿造过程四甲基吡嗪形成规律及稳定性研究

四甲基吡嗪是山西老陈醋中重要的风味与功能物质之一,该文对山西老陈醋整个酿造过程中四甲基吡嗪变化规律进行了分析。醋酸发酵和熏醅阶段是其含量增加的主要阶段。进一步分析了乙偶姻、双乙酰、铵以及16种氨基酸等四甲基吡嗪主要前体化合物在醋酸发酵阶段的变化规律,重点分析了温度对四甲基吡嗪生成及其稳定性的影响。结果表明,熏醅过程四甲基吡嗪处于生成和降解的动态平衡,高温和乙酸是四甲基吡嗪降解的主要原因。95℃熏醅3 d时四甲基吡嗪含量与85℃和105℃条件下熏醅相比分别提高30%和17%,总酯含量提高9%和10%,并且增加了酯类、酮类、醛类和杂环类风味物质相对含量,总酸、还原糖和氨基态氮等指标无显著差异,说明95℃熏醅温度更有利于四甲基吡嗪等风味物质的积累。     

bdhA基因敲除及发酵条件优化提高枯草芽孢杆菌四甲基吡嗪含量研究

四甲基吡嗪是白酒重要风味物质的组成成分,赋予白酒一定的健康功效。为提高菌株发酵产四甲基吡嗪的含量,本研究以枯草芽孢杆菌E20为原始菌株,利用同源重组敲除其2,3-丁二醇脱氢酶（BDH）的编码基因（bdhA）,成功构建突变菌株E20-ΔbdhA。将突变菌株和原始菌株接种到黄豆发酵培养基模拟产酱香固态发酵。结果表明,突变菌株发酵物中四甲基吡嗪的含量为100.45 mg/kg,比原始菌株提高了71.97%,酱香风味无明显变化。利用突变菌株E20-ΔbdhA对其固态状态下合成四甲基吡嗪的条件进行优化,确定当种子菌液接种量为5%,发酵培养基为高粱小麦（1∶1）,(NH4)2HPO4的添加量为70 g/kg时,发酵物中四甲基吡嗪的含量最高为380.61 mg/kg。     

浓香型白酒中高含四甲基吡嗪酿造工艺的研究

为了进一步提高浓香型白酒中以四甲基吡嗪为代表的健康功能成分,使用强化了高产四甲基吡嗪地衣芽孢杆菌的大曲,考察了不同用量条件下,其对酿酒过程参数,产品品质及出酒率等因素的影响。结果表明采用60%比例的功能曲,可以浓香型原酒中四甲基吡嗪含量提高到3~6mg/L;较传统浓香型白酒提高了5~20。同时感官品评的结果也表明:使用功能性大曲白酒口感和纯净度都有不同程度提高。     

清香型白酒大曲中高产四甲基吡嗪菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化

为通过生物法改善并提高清香型白酒酿造中功能性成分四甲基吡嗪的含量,该研究采用传统分离方法从清香型白酒大曲中分离纯化芽孢杆菌（Bacillus sp.）,通过气相色谱（GC）法筛选高产四甲基吡嗪的菌株,通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并对其产四甲基吡嗪发酵培养基配方进行研究。结果表明,共分离得到31株芽孢杆菌,从中筛选得到7株产四甲基吡嗪的芽孢杆菌,其中菌株q94的四甲基吡嗪产量最高,为（0.36±0.01）g/L,其被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌株q94产四甲基吡嗪的最优培养基组成为：蔗糖80 g/L,蛋白胨10 g/L、酵母浸粉20 g/L、磷酸氢二铵30 g/L、磷酸二氢钾15 g/L,在此优化条件下,菌株q94的四甲基吡嗪产量可达（3.32±0.18）g/L。     

酱香大曲中产四甲基吡嗪细菌的分离鉴定及其功能性研究

采用稀释平板涂布法从酱香型白酒大曲中分离筛选出细菌菌株19株,模拟酱香型白酒生产发酵工艺,获得2株固态发酵产物具有浓郁酱香气味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。结合菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。研究发现,菌株FBKL1.0199具有高产蛋白酶的特性,其中性蛋白酶活力达3 925. 80 U/g,酸性蛋白酶活力也相对较高,达139.27 U/g。同时,利用固相微萃取-气质联用技术对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201模拟白酒固态发酵的挥发性香味物质进行分析,发现其中吡嗪类物质相对含量较高,分别为46.01%和48.32%,且均以四甲基吡嗪为主,含量分别为44.11%和47.41%。分离得到的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201可以作为产四甲基吡嗪的功能菌。     

2,3-丁二醇调控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌产物产量的研究

发酵初期在枯草芽孢杆菌发酵培养基中添加2,3-丁二醇(2,3-BD)可以调控发酵产物乙偶姻,四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)的产量。随着2,3-BD添加量的增加,所产乙偶姻和TTMP的量随之增加,当2,3-BD的添加量≥4.0 g/L时,乙偶姻和TTMP的产量不再增加。同时,枯草芽孢杆菌的生物量、糖转化率也随之变化。该调控方法对枯草芽孢杆菌的分子改造菌株(Δbdh A)调控产乙偶姻和TTMP的产量影响不大。     

加热强化大曲对酱香型白酒酿造的影响研究

将加热强化工艺制成的高温大曲应用于酱香型白酒酿造的第四轮次发酵,考察加热强化大曲对酿造过程及酱香型白酒酒质和四甲基吡嗪形成的影响。结果表明,加热强化大曲组在糟醅酸度、水分、发酵温度、乙偶姻含量等多方面指标与常规曲组差异较大。酒样分析结果表明,加热强化大曲组在控制酒体总酸、平衡乙酸乙酯和乳酸乙酯比例等方面表现较好,加热强化大曲组四甲基吡嗪含量由常规曲组的未检出提升至0.13 mg/100 mL。感官评价结果显示,加热强化大曲组酒样酱香突出,酒体醇厚,显著优于常规曲组,且各组酒样风味物质含量与酒体感官评价呈现一定关联性。     

酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测及特点

建立了白酒中8种吡嗪化合物的液相色谱串联质谱检测方法。通过检测结果找出酱香型白酒中吡嗪化合物的特点（8种吡嗪化合物中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量较高）,同时对真假茅台酒酒样中8种吡嗪化合物进行测定,并将检测结果进行分析,其中真茅台酒四甲基吡嗪的含量远远高于其他吡嗪化合物,含量在9.25～28.3 mg/L,假茅台酒中四甲基吡嗪的含量在0.89～12.5 mg/L。该方法对提高酱香型白酒质量及真伪酒的鉴别提供参考。     

利用现代生物技术提高大曲中四甲基吡嗪含量的研究

大曲是浓香型白酒生产的糖化发酵剂,其为浓香型白酒独特的风格形成提供了独特的微生物体系、酶系及风味物质前体。为了进一步丰富浓香型白酒健康功能成分,提升原酒健康风味品质与健康内涵,以提高大曲中四甲基吡嗪含量为目标,将筛选得到的一株吡嗪类合成能力较强的菌株应用到大曲中,将大曲中四甲基吡嗪含量提高到100mg/kg～380mg/kg,较传统中高温曲提高了4～10倍,并对大曲的风味体系进行了分析。     

高产四甲基吡嗪细菌的筛选鉴定及应用研究

从宋河中高温大曲中筛选到1株产吡嗪类微生物,利用发酵培养基对该菌株进行发酵,气相色谱-质谱联用对发酵液成分进行分析,气相色谱对发酵液中四甲基吡嗪进行定量分析得出该菌株四甲基吡嗪含量高达25 mg/L,经形态学和分子生物学鉴定该菌株为Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）。该菌株应用于芝麻香白酒堆积过程能明显提升芝麻香白酒的焦香,提升芝麻香型白酒质量。