Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒

目的 采用Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒。方法 将Vero细胞分别采用无血清和有血清培养基于生物反应器(pH 7.2,温度37℃,溶氧量50%,转数60 r/min)中培养24 h,均用无血清培养基进行灌流培养至7 d,进行计数,并按MOI=0.1接种H1N1型流感病毒,加入终浓度为1μg/mL的TPCK-胰酶,于生物反应器(pH 7.8,温度33.0℃,溶氧量25%,转数60 r/min)中培养18、22、42、48、66 h,取样,检测血凝效价。结果 Vero细胞经无血清和有血清培养基培养7 d的细胞数分别为(133.4±2.0)×10⁴和(193.8±1.3)×10⁴个/mL,接种H1N1流感病毒66 h后血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675,前者细胞数及病毒血凝效价几何平均数均显著低于后者(t分别为7.068和4.332,P均<0.05)。结论 采用Vero细胞通过生物反应器微载体无血清培养H1N1型流感病毒的血凝效价可满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。     

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7))、胰酶终浓度(2. 5、5、7. 5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10~4、100×10~4、300×10~4、500×10~4、700×10~4个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10~(-2)、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10~4个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度(CCID_(50))均明显高于贴壁培养的MDCK细胞(P 0. 05)。结论优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件,为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。     

以MDCK为基质的H5N1流感全病毒灭活疫苗的制备及其免疫学评价

目的利用生物反应器培养技术大规模制备以MDCK细胞为基质的H5N1流感全病毒灭活疫苗,并进行免疫学评价。方法利用7.5 L生物反应器,以5 g/L微载体培养MDCK-G1细胞,当细胞密度达到1.5×106或2.5×10^6个/mL时,以0.001、0.0001、0.00001 MOI接种H5N1流感病毒,每12 h取样检测流感病毒血凝滴度,并观察细胞形态;利用40 L生物反应器进行放大培养,收获病毒液后进行纯化。以不同剂量的细胞基质和鸡胚基质流感疫苗免疫BALB/c小鼠及攻毒,检测免疫原性。结果当细胞密度达1.5×10^6个/mL时,以0.0001 MOI接种H5N1流感病毒48 h后,流感病毒滴度可达1∶1024。纯化后病毒液杂蛋白去除率为91.2%,回收率为87.9%,总蛋白与HA比值低于4.5,符合《中国药典》三部(2015版)相关规定。各剂量组细胞基质疫苗血凝抑制试验中和抗体滴度略高于鸡胚基质疫苗,其中10μg剂量组差异无统计学意义(P>0.05),0.1μg剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。细胞基质疫苗及鸡胚基质疫苗组小鼠体重均有下降再恢复的过程,二者对小鼠体重的影响差异不大;1、0.1μg剂量组细胞基质疫苗保护率为80%和40%,高于鸡胚基质疫苗的70%和30%,但差异均无统计学意义(P>0.05),10μg剂量组均为100%。结论建立了以MDCK细胞为基质的H5N1流感病毒的生物反应器培养工艺,细胞基质流感病毒灭活疫苗免疫原性和安全性方面均非劣效于鸡胚基质流感疫苗,是未来流感疫苗的发展方向。本研究为细胞基质流感疫苗的研制及生产奠定了基础。     

Vero细胞培养H3N2流感病毒冷适应株条件的优化

目的对Vero细胞培养H3N2流感病毒条件进行优化。方法使用Vero细胞培养H3N2流感病毒,对病毒感染复数(MOI)、吸附时间、维持液中NaHCO_3含量、TPCK-胰酶终浓度和细胞病变效应(CPE)等培养条件进行优化。结果在MOI为0. 05,病毒吸附1. 5 h,病毒维持液中6. 6%NaHCO_3溶液加入量为2%,TPCK-胰酶终浓度为1 mg/L,40%～50%细胞出现CPE情况下收获病毒,血凝(hemagglutination,HA)效价最高。结论优化后的培养条件可用于大规模流感疫苗的生产。     

甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上增殖条件的优化

目的确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。方法将3株甲型流感病毒(H1N1 NYMC X-181、H1N1 NYMC X-275和H3N2 NYMC X-263B)在贴壁MDCK细胞上进行传代培养,以其血凝效价和半数细胞感染剂量(median cell culture infective dose,CCID50)为检测指标,分别对其增殖条件胰酶浓度(0.5、1.25、2.5、3.5和4.5μg/m L)、MOI(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1)、培养温度(33、34、35、36、37℃)、吸附时间(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、培养时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。结果 H1N1 NYMC X-181、H1N1 NYMC X-275和H3N2 NYMC X-263B 3株流感病毒在贴壁MDCK细胞上增殖的最适胰酶浓度分别为2.5、1.25、1.25μg/m L;最适MOI值均为0.01;最适培养温度均为34℃;最适吸附时间分别为1.5～2.0、1.5、1.5 h;最适培养时间均为72 h。结论确定了3株甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上的增殖条件,为后续相关疫苗的研发工作奠定了基础。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

用无血清适应的Vero细胞培养H5N1型流感病毒条件的优化

目的优化无血清适应的Vero细胞(SFM-Vero细胞)培养H5N1型流感病毒的条件。方法将H5N1型流感病毒接种于SFM-Vero细胞,于免疫荧光显微镜下观察病毒感染情况。对病毒无血清培养条件MOI(0.05、0.10、0.15、0.20)、细胞培养时间(12、24、36、48 h)、培养液基础培养基(DMEM/F12、M199、RPMI1640及MEM:DMEM/F12混合液)、培养温度(33、33.5、34、34.5、35和37℃)、收获时间(24、36、48、60和72 h)、培养液p H值(6.8、7.1、7.4、7.7、8.0和8.3)和TPCK胰酶浓度(0.5、1.0、1.5μg/ml)进行优化,并检测最佳条件无血清培养的H5N1型流感病毒的血凝效价及形态。结果 H5N1型流感病毒对SFM-Vero细胞具有感染性。最佳无血清培养条件为:MOI=0.1和0.15,细胞培养时间36 h,以DMEM/F12为基础培养基,病毒培养温度33.5和34.5℃,病毒收获时间60 h,培养液p H 7.7,TPCK胰酶浓度为1.0μg/ml。最佳条件无血清培养的H5N1型流感病毒的血凝效价为1∶512,电镜下观察病毒形态完整。结论确定了H5N1型流感病毒对SFM-Vero细胞具有感染性,并优化了SFMVero细胞培养流感病毒的适宜条件,为更具有生物安全性流感疫苗的研发奠定了基础。     

微载体浓度与细胞接种密度对MDCK细胞生长的影响

目的探讨微载体浓度与犬肾脏上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞接种密度之间的关系,及其对MDCK细胞生长代谢的影响。方法实验设计了4组不同的单个微载体周围的细胞数范围,分别为0~10、10~20、20~60和60~120个,每组范围分别通过控制微载体浓度或细胞接种密度得到2组不同条件的实验组,即12 g/L微载体组和5×104个/ml MDCK细胞组、7 g/L微载体组和1×105个/ml MDCK细胞组、3 g/L微载体组和5×105个/ml MDCK细胞组、1 g/L微载体组和1×106个/ml MDCK细胞组,其中1、3、7、12 g/L微载体组细胞接种密度均为2×105个/ml,5×104、1×105、5×105、1×106个/ml MDCK细胞组微载体浓度均为3 g/L。经转瓶培养,每隔24 h取样,进行细胞计数,并检测细胞代谢。按确定的最佳细胞接种密度和微载体浓度培养MDCK细胞72 h后,接种0.01 MOI的甲型流感病毒株A/PR8/34,检测病毒的HA效价。结果当一个微载体周围的细胞数控制在20~60个之间,微载体浓度为3 g/L,细胞接种密度为5×105个/ml时,活细胞密度(viable cell density,VCD)可达3×106个/ml以上,细胞在72~96 h之间,能获得一个较为稳定的平台期,葡萄糖等营养物不会消耗过多以致耗竭,而乳酸、氨等代谢副产物的累积对培养环境造成的压力较小,有利于后期流感病毒的接种,同时还可达到理论最高活细胞值的60%以上。HA效价可达12 log2HA units/50μl。结论控制单个微载体周围细胞数在20~60个之间,细胞生长和代谢显著优于其他条件,且有利于病毒的复制,提高了病毒滴度。为基于MDCK细胞大规模高效生产流感病毒疫苗的工业化生产提供了数据参考。     

流感病毒疫苗株在MDCK细胞中增殖条件的优化

目的 优化四价流感裂解疫苗中 H1N1(IVR-180)、H3N2(IVR-186)、BV(.NYMC BX-69A)、BY(B/Phuket/3073/2013)亚型疫苗株在MDCK细胞中的增殖条件.方法 以血凝滴度和半数组织感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID...     

流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10~4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10~4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCK-G1细胞上的遗传稳定性

目的分析H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCK-G1细胞上的遗传稳定性。方法将H5N1种子毒株在MDCK-G1细胞上传代,收获病毒液作为P2病毒,继续传至P15,每隔5代[即P1(原代)、P5、P10、P15]进行测序。分别以含不同浓度(1、2、4μg/mL)TPCK-trypsin的培养基及不同病毒接种MOI(1、0. 1、0. 01、0. 001、0. 000 1、0. 000 01)在MDCK-G1细胞上培养P1 H5N1病毒,检测血凝滴度,计算CCID50,确定最适MOI及TPCK-trypsin浓度。将P1和P15 H5N1病毒接种鸡胚,收获尿囊液,经Sepharose 4 Fast Flow凝胶柱层析法纯化病毒后,进行电镜观察;采用培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)检测支原体。结果 H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCKG1细胞传代过程中血凝滴度增加,从1∶128升至1∶1 024,P1、P5、P10和P15 H5N1种子病毒8条基因序列(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS)经DNAMAN比对结果一致。H5N1种子病毒株在MDCK-G1细胞传代的最适TPCKtrypsin浓度为4μg/mL,最适MOI为0. 001。两种方法检测P1、P15 H5N1种子病毒株均未被支原体感染。结论H5N1种子病毒株在MDCK细胞中传至P15时,病毒滴度增加但基因序列未发生改变,表明H5N1种子病毒株在MDCK-G1细胞中传代具有一定的遗传稳定性。     

B型流感病毒在MDCK细胞上的遗传稳定性

目的研究流感病毒NYMC BX-51B株在MDCK细胞上连续传代的遗传稳定性。方法将SPF级鸡胚制备的流感病毒NYMC BX-51B尿囊液毒株接种至MDCK细胞上,连续传代培养至10代(M1～M10),参照《中国药典》三部(2015版)毒种检定方法进行支原体和无菌检查、外源因子检查、鉴别试验,并进行血凝试验和病毒滴度检测。提取尿囊液、M1代、M10代病毒总RNA,RT-PCR法扩增血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,并进行测序。结果流感病毒NYMC BX-51B株在MDCK细胞上连续传代培养至M10代,血凝滴度最高可达1∶256,病毒滴度最高可达6. 5 LgCCID_(50)/mL;鉴别试验、无菌检查、支原体检查、外源因子检查结果均符合药典要求。尿囊液、M1代、M10代病毒的HA和NA基因的氨基酸序列与GenBank中登录的流感病毒NYMC BX-51B的HA和NA基因比对结果完全一致。结论 NYMC BX-51B型流感病毒在MDCK细胞基质上连续传代培养至M10代,遗传稳定性良好,为MDCK细胞基质流感疫苗的研究和生产奠定了基础。     

生物反应器微载体放大培养Marc-145细胞及PRRSV增殖情况

目的确定不同级别生物反应器间Marc-145细胞在微载体上消化放大培养条件,实现Marc-145细胞二级放大后,在生物反应器内增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。方法在一级生物反应器(BC-7L型)内,以微载体密度4 g/L培养Marc-145细胞,培养72 h时经灭菌PBS漂洗、胰酶消化后,接种至二级生物反应器(BC-14L型)继续培养,实现反应器间微载体细胞5倍体积增殖培养。以0.05 MOI接种PRRSV(TJM-F92株),接毒后24、36、48、60、72 h分别取上清及全液样品,检测病毒效价(TCID50)。结果 Marc-145细胞经过一级生物反应器培养72 h后,细胞密度达28.7×105个/ml;消化放大后,二级生物反应器培养72 h后,细胞密度达24.9×10~5个/ml。接毒后36 h,样品效价峰值可达108.19 TCID50,上清与全液样品效价差异较小。结论 Marc-145细胞从BC-7L型到BC-14L型不同反应器之间进行放大培养是可行的,为PRRSV活疫苗新型工艺改进及大规模放大生产奠定了基础。     

两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

夏桑菊对甲型H1N1流感病毒的作用及其机制

目的探讨夏桑菊对甲型H1N1流感病毒的作用及其机制。方法 MTT法检测夏桑菊对MDCK细胞的半数有毒浓度(TC50)及对甲型H1N1流感病毒半数抑制浓度(IC_(50)),并计算选择指数(selection index,SI);Reed-Muench法检测甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的半数感染量(TCID50);空斑减少试验检测夏桑菊对甲型H1N1流感病毒的作用;荧光染色法观察夏桑菊对流感病毒NP蛋白的核定位作用;Western blot法检测夏桑菊作用流感病毒感染细胞后NF-κB通路相关蛋白的表达情况。结果 TC_(50)为4.98 mg/m L,IC_(50)为2.063 mg/m L,SI为2.414,TCID_(50)为0.044 668;甲型H1N1流感病毒经夏桑菊作用后,抑制了病毒株的空斑形成、病毒NP蛋白的核输出及NF-κB通路相关蛋白Iκκα、Iκκβ、NF-κBp50、NF-κBp65的磷酸化。结论夏桑菊对甲型H1N1流感病毒有明显的抑制作用,可能是通过抑制NF-κB通路相关蛋白磷酸化实现的。     

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。     

生物反应器微载体Vero细胞罐外消化放大培养对狂犬病病毒CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响

目的 探讨微载体Vero细胞从30 L生物反应器经罐外细胞消化放大培养至300 L生物反应器对狂犬病病毒(rabies virus,RABV)CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响。方法 将第140代Vero细胞于37℃培养72～120 h后,按1∶4的细胞密度比传代扩增至10层细胞工厂,继续培养72～120 h;将单层致密细胞消化后接种至30 L生物反应器,微载体7～10 g/L,培养温度37℃,pH(7.0～7.4),溶氧30%～80%,搅拌速度10～50 r/min,连续灌流培养72～120 h,共培养3批;微载体Vero细胞经罐外细胞消化后放大培养至300 L生物反应器,微载体5～8 g/L,培养温度37℃,pH(7.0～7.4),溶氧30%～80%,搅拌速度30～80 r/min,灌流培养72～120 h;按MOI=0.05接种RABV CTN-1Ⅴ株,每24 h收获病毒液1次,检测病毒滴度和抗原含量。结果 30 L生物反应器微载体Vero细胞培养96 h后密度约为1×10⁷个/mL;300 L生物反应器微载体Vero细胞培养96 h后密度约为7.4×10