去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索

目的探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题。方法选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经Capto SP Imp Res柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析。结果使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下。在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势。结论使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究。     

百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化

目的采用新型层析介质对无细胞百日咳疫苗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamen-toushemagglutinin,FHA)和黏附素(pertactin,PRN)3组分进行分离纯化。方法调整PT和FHA发酵液上清的pH值和电导后,PT经Capto SP ImpRes和Capto MMC进行两步层析,FHA经Capto SP ImpRes进行一步层析;PRN热处理原液经Capto Adhere和Capto SP ImpRes进行两步层析。纯化产物经4%～12%NuPAGE进行鉴定,ImageQ分析纯度;LC-MASS(Thermo LTQ Velas)进行蛋白质的质谱检测;PT和FHA经BiaCore T200进行定量分析,并计算各步回收率。结果纯化后,无细胞百日咳疫苗3组分纯度均达95%以上;PT和FHA的总回收率均在30%左右;电泳图谱上的各组分条带经LC-MASS鉴定,均与Uniprot Bordetella pertussis数据库数据高度同源。结论采用新型层析介质有效纯化了无细胞百日咳疫苗PT、FHA和PRN,提高了抗原纯度,大大缩短了生产时间。     

抗肝癌基因疫苗内毒素去除方法的建立

目的建立去除抗肝癌基因疫苗pVAX1-aLCGV内毒素的方法。方法采用Triton X-114液相分离法去除抗肝癌基因疫苗中的内毒素,鲎试剂法检测疫苗中的内毒素含量,家兔法复试,ELISA法检测内毒素入血前后血浆中细胞因子TNF-α和IL-8的含量及疫苗的免疫原性,并比较处理前后的基因疫苗转染SMMC-7721和HepG2细胞的转染效率。结果经Triton X-114处理后,基因疫苗的内毒素含量及热原检测均合格;内毒素入血后,血浆中TNF-α和IL-8的含量均明显升高;疫苗的免疫原性与处理前比较,差异无统计学意义;处理后疫苗质粒的细胞转染效率增高。结论 Triton X-114能有效去除基因疫苗pVAX1-aLCGV中的内毒素,为其临床应用奠定了基础。     

温度诱导双水相分离纯化细菌素工艺条件的选取与优化

利用TritonX-114可萃取疏水性蛋白质的性质,研究了温度诱导双水相分离纯化细菌素乳链菌肽, 用响应面法对成相成份TritonX-114和离子强度进行了优化,最佳浓度分别为3.27% TritonX-114,0.85 mol/L氯化钠. 优化过程中,pH固定为2.0,温度固定为30℃, 在此条件下乳链菌肽的萃取率为92%,纯化系数为9.05.     

相分离联合层析去除类人胶原蛋白中的内毒素

研究类人胶原蛋白(HLC)中内毒素的去除方法,为规模化制备医用生物材料提供参考。采用Triton X-114双水相分离法作为内毒素去除工艺的第1步,亲和层析法作为工艺的第2步,二者偶联操作从类人胶原蛋白中除去内毒素,并对除去内毒素后的HLC进行了理化性能检测。结果表明:采用Triton X-114双水相分离法,在蛋白质量浓度2.06 mg/m L,作用温度44.71℃,作用时间3 h,溶液pH值为7时双水相分离系数K=9.58,蛋白中内毒素含量由10 000—25 000 EU/mg下降为1.5—2.0 EU/mg,蛋白回收率为95.6%;偶联了多聚赖氨酸亲和配基的亲和层析后,HLC中内毒素含量由1.5—2.0 EU/mg降至0.025—0.25 EU/mg,蛋白回收率可达81.9%;2步操作均不会使蛋白发生相对分子质量及化学结构的改变。此工艺操作简便,可显著降低生产成本。     

抗百日咳丝状血凝素单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的制备抗百日咳丝状血凝素(FHA)的单克隆抗体,并建立特异、准确的FHA定量检测方法。方法采用杂交瘤技术制备McAb,以ELISA间接法筛选稳定分泌抗FHA-McAb的杂交瘤细胞株,并进行系统的鉴定和纯化,建立定量检测FHA的ELISA方法。结果获得6株分泌抗FHA-McAb的杂交瘤细胞株,抗体类别均为IgG1(κ),效价达1∶105~1∶106,并能特异性识别FHA,与流感病毒血凝素及百日咳毒素无交叉反应,应用ELISA检测FHA的灵敏度为1.04μg/L,批内变异系数为5.49%,批间变异系数为9.31%,平均回收率为94.18%。结论已成功制备了抗FHA-McA,建立了一种特异、准确地定量检测FHA的ELISA方法,可用于无细胞百日咳疫苗原液中FHA含量的检测,为该疫苗的质量控制提供了有力的手段。     

无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法的建立及适用性的初步验证

目的建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证。方法采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证。在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析。结果建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.7500和59.0625mEU/ml,检测限量分别为100和70mEU/ml。将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义,且PSPT法比MICA法重复性更好。结论抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高,准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价。     

无毒性逆转的无细胞百日咳菌苗制备

将百日咳菌培养物上清液,经一段硫酸铵盐析提取百日咳主要保护性抗原 FHA 和 PT,用蔗糖密度梯度离心去除内毒素,以戊二醛解毒制成无细胞百日咳菌苗。该菌苗对家兔不产生热原反应,对小鼠毒性低,不引起明显的白细胞增多及组胺致敏活性,小鼠免疫后对百日咳毒菌脑腔攻击具有很好的保护作用,并可产生较高的抗体应答。菌苗经37℃保存3个月未出现毒性逆转现象,质量稳定,为大批量制造质量均一的无细胞百日咳菌苗提供了可能性。     

无细胞百日咳疫苗质量控制方法的建立

目的建立我国无细胞百日咳疫苗组分含量和纯度的检测方法。方法应用ELISA方法对生产过程中组分含量(PT和FHA)进行分析,SDS-PAGE和PAGE方法对疫苗原液中PT和FHA的纯度进行测定。结果通过对生产过程中组分含量的测定,绘制出组分动态图,可以实时监控生产过程中有效组分的变化。检测疫苗原液中PT和FHA纯度的SDS-PAGE法的分辨率较高,但PAGE法条带少,易于分析。结论所建立的质量控制方法可用于我国无细胞百日咳疫苗的质量控制。     

非限制性核酸内切酶对狂犬病疫苗中Vero细胞DNA的去除作用

目的评价非限制性核酸内切酶对狂犬病疫苗中Vero细胞DNA的去除效果。方法将不同终浓度的Benzonase非限制性核酸内切酶加入狂犬病病毒收获液中,在PBS或Tris两种缓冲体系下,以不同温度酶解不同时间,经分子筛层析纯化后,采用罗氏Ⅱ型高效地高辛DNA标记和检测试剂盒检测狂犬病病毒收获液中DNA的残留量,用确定的酶处理条件,采用酶检测试剂盒检测狂犬病病毒收获液中非限制性核酸内切酶的残留量,采用ELASA法检测抗原含量。结果非限制性核酸内切酶的处理浓度为50~90 U/ml,缓冲体系为PBS或Tris,经37℃处理2~3 h,转入18~26℃处理12~18 h酶解,再经分子筛层析纯化后,狂犬病病毒收获液中的Vero细胞DNA去除率在80%以上,病毒抗原回收率在75%以上;用确定的酶处理条件处理狂犬病病毒收获液,可使狂犬病病毒与Benzonase非限制性核酸内切酶完全分离。结论采用非限制性核酸内切酶可有效去除狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA。     

应用复合纯化介质Capto Core700纯化狂犬病疫苗

目的应用复合凝胶Capto Core700作为纯化介质去除狂犬病疫苗中的Vero细胞宿主蛋白和宿主细胞DNA等杂质。方法将Vero细胞接种至微载体,在celligen plus生物反应器中培养,按MOI=0.002接种狂犬病病毒,连续制备10批狂犬病疫苗原液。经过滤及浓缩后加入β-丙内酯,于2~8℃灭活24 h,获得病毒灭活液。上样至装载复合凝胶Capto Core700的纯化柱进行层析纯化,并按《中国药典》三部(2015版)的方法检测宿主细胞蛋白去除率、宿主细胞DNA去除率、狂犬病病毒糖蛋白回收率及总蛋白去除率。同时与传统Sepharose系列凝胶纯化方法进行比较。结果 10批疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率为58.3%~63.2%,宿主细胞DNA去除率均90%,糖蛋白回收率范围为52.3%~74.5%,蛋白去除率范围为7.22%~11.76%。与传统Sepharose系列凝胶纯化方法比较,差异较小,且Capto Core700的上样量为3倍柱体积,高于Sepharose凝胶(15%)。结论 Capto Core700凝胶可有效去除狂犬病疫苗中的杂质,缩短了纯化工艺时间。     

测定含甘油牛血清白蛋白样品Lowry法的优化及验证

目的优化《中国药典》三部(2015版)通则50中Lowry法2试验条件,进一步提高检测结果的准确性,并进行方法学验证,为柱纯化组分百日咳疫苗中间品蛋白准确定量提供参考。方法用Lowry法2测定经脱氧胆酸钠-三氯乙酸预处理的不同浓度且含50%甘油的牛血清白蛋白,使福林酚反应在20℃水浴条件下分别静置30、40和50 min,筛选出蛋白含量测定值相对误差最小的反应时间;再在10、20和30℃条件下,筛选出相对误差最小的反应温度。对该方法进行精密度、准确度、专属性验证,并确定线性范围。结果福林酚反应温度为30℃、反应时间为30 min时,测定值的平均相对误差最低,与其他试验条件的差异有统计学意义(P0.05)。在该试验条件下,同一工作日不同试验人员间及同一试验人员不同工作日检测结果的RSD均小于2.00%,重复性检测结果 RSD为0.50%,精密度良好;30、50和70μg/m L蛋白溶液测定值的RSD均小于2.00%,回收率在99%~102%之间,可对蛋白准确定量;含甘油50μg/m L蛋白溶液的回收率及其RSD分别为102%和0.50%;不含甘油对照组回收率和RSD分别为100%和0.82%,专属性良好;在0~140μg/m L标准范围内,检测含甘油样品的测定范围在15~140μg。结论采用Lowry法2测定含高浓度甘油的蛋白样品时,福林酚反应温度、反应时间是影响试验结果的重要因素。30℃条件下反应30 min,可提高测定结果的准确性,符合且更有利于柱纯化组分百日咳疫苗中间品的蛋白定量的要求。     

百日咳杆菌无动物源培养基的筛选及其对百日咳毒素和丝状血凝素产量的影响

目的确定百日咳杆菌无动物源培养基最佳配方,并检测其对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)产量的影响。方法分别按一定比例混合使用或单独使用无动物源蛋白Hy Pep5603(小米和小麦蛋白)、精选大豆胨,替代培养基中动物源性成分(酸水解酪蛋白)作为氮源,进行百日咳杆菌摇瓶培养,比较细菌生长密度和产物生产量。以最高PT和FHA产量为参考标准,确定最佳培养基配方。用该配方与动物源培养基对比,进行4批30 L百日咳杆菌发酵培养;发酵液处理后,用离子交换层析分离PT和FHA样品,ELISA法测定各样品中PT和FHA的蛋白含量,SDS-PAGE法检测产物的相对分子质量大小。结果由无动物氮源Hy Pep56034.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L加改良SS培养基组成的培养基,摇瓶培养百日咳杆菌后最高A550为3.8,发酵百日咳杆菌后最高A550为5.8,均能有效地供菌体生长,且优于单独使用动物源或无动物源培养基;用该配方发酵百日咳杆菌并纯化,获得PT的产量约为5.7 mg/L,FHA产量约为23.0 mg/L,均高于用动物源培养基培养后的产物,且相对分子质量大小一致。结论用含Hy Pep5603 4.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L的无动物源培养基培养百日咳杆菌,可替代动物源培养基,用于PT和FHA的生产。     

比浊法检测疫苗中TritonX-100残留量的方法学验证

目的建立检测疫苗中Triton X-100残留量的比浊法,并进行方法学验证。方法将TritonX-100与5%苯酚溶液充分混匀后,室温静置15 min,采用比浊法测定340 nm处吸光度值,与经同样处理的标准品绘制的标准曲线比较,计算样品中残留TritonX-100的浓度。由4名试验人员连续3 d测定12次,评价不同试验人员建立标准曲线的成功率;由同一试验人员在同一试验内和不同时间内及由4名试验人员在不同时间内分别测定低(15μg/ml)、中(25μg/ml)、高(45μg/ml)3个不同浓度的TritonX-100的浓度,验证该方法的精密度和准确度;并检测BSA对试验准确度和精密度的影响。结果 4名试验人员连续3 d的12次检测结果均满足标准曲线的成立条件,成功率为100%;同一试验人员在同一试验内对低、中、高3个不同浓度的TritonX-100溶液重复测定10次,变异系数分别为分别为5.33%、1.19%和1.39%,回收率分别为99.33%、105.60%和110.67%;同一试验人员在不同时间内连续测定3次,变异系数分别为4.94%、7.49%和3.46%,回收率分别为87.75%、93.85%和95.51%,4名试验人员在不同时间内连续测定3次,变异系数在1.73%~12.17%之间,回收率在89.55%~99.26%之间,灵敏度为10μg/ml,具有良好的精密度和准确度;BSA对试验准确度和精密度无显著影响。结论该方法快捷、简便,可灵敏、准确地定量检测TritonX-100的含量,可用于疫苗样品中残留TritonX-100的质量控制。     

无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。     

无细胞百日咳纯化抗原中Triton X-100残留量检测方法的建立及验证

目的建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测无细胞百日咳纯化抗原中Triton X-100残留量,并对该方法进行验证及初步应用。方法 HPLC条件:Agilent SB 300 C18色谱柱(规格:4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:纯化水与甲醇的体积比为20﹕80;检测波长:225 nm;色谱柱温:30℃;流速:0.8 ml/min;进样量:10μl。对方法的系统适应性、专属性、线性、准确性、精密性、耐用性及定量限进行验证,并用建立的方法检测6批无细胞百日咳纯化抗原中的Triton X-100残留量。结果该方法检测6份10μg/ml Triton X-100的理论塔板数在1 550~1 580之间,Triton X-100峰面积和保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为2.59%和0.04%;12μg/ml的Triton X-100溶液和无细胞百日咳纯化抗原样品中,Triton X-100能与其他物质完全分离;在2~30μg/ml范围内,Triton X-100浓度与峰面积呈良好的线性关系(r2=0.999 01);该方法检测不同浓度Triton X-100样品的加标回收率均在98%~102%之间,RSD均不超过2%;同一实验人员在不同工作日和不同检测人员在同一工作日用该方法检测供试品中Triton X-100含量的RSD均小于4%;改变流动相的甲醇比例和柱温后,6次检测值的RSD分别为0.95%和0.51%;定量限可达0.5μg/ml。该方法检测6批无细胞百日咳纯化抗原中的Triton X-100残留量均较低。结论建立的HPLC法系统适应性、专属性、线性、准确性、精密性、耐用性良好,可用于无细胞百日咳纯化抗原中Triton X-100残留量的定量检测。     

多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA

目的采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA。方法采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价。结果 0.45μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求。结论多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化

目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。     

Triton X-114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素

目的采用Triton X-114萃取法去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素。方法1% Triton X-114与多糖溶液在0℃混合均匀,分别加热至25、37和56℃,观察分层情况。离心后收集上层水相,对其中残余萃取剂Triton X-114进行去除方法的选择。比较多糖浓度对萃取的影响及二次萃取的效果,并对终产物进行全面检定。对W135群和Y群脑膜炎球菌多糖进行萃取效果比较。结果最终选择56℃10min作为升温条件,3000r/min离心10min后,上清中多糖的内毒率含量均减少85%以上,多糖回收率不低于80%。残余的Triton X-114选择透析法去除。多糖浓度越低,越易于萃取。二次萃取多糖回收率大于85%。内毒素含量可降低至0.706EU/μg多糖。经检测,终产物多糖的相对分子质量未发生改变,免疫原性与萃取前差异无显著意义,异常毒性、多糖及内毒素含量合格。蛋白含量稍有增加,核酸含量降低。W135群和Y群脑膜炎球菌多糖的萃取结果与A群多糖相似。结论Triton X-114萃取法可以用于去除脑膜炎球菌多糖中的内毒素。     

两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围。取抗原含量最高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量。结果 Sepharose 6FF填料按6%柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69%、78.03%和78.37%,与Sepharose CL-6B填料按3%柱体积上样(77.29%、78.60%和77.36%)相比,差异无统计学意义(P0.05)。两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P0.05)。结论使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B。