CDAP活化多糖制备5型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗

目的用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)代替溴化氰(CNBr)活化5型肺炎链球菌荚膜多糖,制备5型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗。方法将5型肺炎链球菌荚膜多糖溶液加CDAP活化,经ADH和缩合剂EDAC与破伤风类毒素进行偶联,经凝胶过滤柱层析纯化,得到5型肺炎链球菌多糖-TT结合物,并对其生化指标、血清学特异性、安全性及免疫原性进行检测。结果多糖-TT结合物的游离多糖含量与多糖的衍化率成反比;血清学特异性良好;经动物实验证明其安全性合格;具有良好的免疫原性,且游离多糖含量越低,免疫原性越强。结论用CDAP活化工艺制备的5型肺炎链球菌荚膜多糖-TT结合物适宜制备疫苗。     

多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响

目的探讨多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响。方法分别用单一载体(破伤风类毒素)和混合载体(破伤风类毒素和白喉类毒素)作为多糖结合物的载体蛋白,制备5～9价肺炎链球菌荚膜多糖结合物,免疫NIH小鼠,采用间接ELISA法测定免疫小鼠血清中抗荚膜多糖特异性IgG抗体水平。结果多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫效果优于相应的单价结合物;随着结合物配制价数的增高,小鼠的免疫应答能力趋于下降;多价结合物中使用两种载体能缓解此现象,但载体含量过高时,依然会抑制免疫应答。结论多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物免疫小鼠后,随着载体剂量的增高,会出现载体诱导的表位抑制现象,使小鼠的免疫应答反应减弱。两种载体蛋白同时使用能缓解此现象。     

B族链球菌表面免疫原性蛋白的免疫原性及其抗体保护功能

目的制备B族链球菌(GBS)表面免疫原性蛋白(Sip),研究其免疫原性及抗体保护功能,为GBS蛋白疫苗研究奠定基础。方法采用基因重组技术构建表达载体,并表达GP-Sip融合蛋白。用pET-Sip融合蛋白免疫小鼠,并免疫家兔制备多克隆抗体。Western blot检测GP-Sip蛋白特异性,ELISA检测家兔及小鼠血清中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的功能。结果表达载体经酶切和测序证明构建正确,GP-Sip蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,纯化后纯度可达90%以上。Western blot显示GP-Sip蛋白可与pET-Sip蛋白的免疫血清发生免疫反应。ELISA显示Sip可诱发小鼠产生高水平的IgG抗体。Sip抗血清具有明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用。结论已成功构建GP-Sip表达载体,并高效表达了Sip。该蛋白具有良好的免疫原性,其抗体具有良好保护功能,可作为GBS蛋白疫苗成分或荚膜多糖疫苗载体成分。     

肺炎链球菌表面蛋白A的研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,Sp)是儿童社区获得性感染的主要病原菌。目前使用较多的7价结合疫苗及23价肺炎链球菌多糖疫苗在长期使用后会出现血清型替换,这可能会使接种疫苗的受益程度下降。寻找新的候选疫苗是有效预防Sp疾病的重要途径,蛋白质疫苗因此备受关注。本文就近年来研究较多的下一代Sp疫苗的重要的候选蛋白质抗原,肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)的研究进展作一简要综述。     

1型和14型肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗中糖链长度与免疫原性的相关性

目的探讨1型、14型肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗中糖链长度和免疫原性的相关性,以解决多糖结合物难以纯化的问题。方法肺炎球菌荚膜多糖经过乙酸水解成为寡糖,与原糖采用相同的方法与破伤风类毒素结合,免疫小鼠后检测抗体水平,并与原糖结合物进行比较。结果小鼠体内均能产生较高的抗体水平,且具有免疫加强效应,寡糖结合物与原糖结合物的免疫原性差异无显著意义。结论1型、14型肺炎球菌的荚膜多糖经酸水解降解,不影响结合物的免疫原性。     

2、9N、17F及20型肺炎链球菌荚膜多糖血清IgG抗体定量检测ELISA法的验证

目的验证2、9N、17F及20型肺炎链球菌荚膜多糖血清IgG抗体定量检测ELISA法。方法采用ELISA法检测2、9N、17F及20型肺炎链球菌荚膜多糖血清Ig G抗体含量,并验证该方法的准确性、精密性、特异性、线性、最低检测限及检测范围。结果 3次加标回收测定各型肺炎链球菌多糖IgG抗体回收率为77.47%~99.33%;连续11次测定质控血清2009S、QC5及QC6各型别多糖抗体的CV值为8.97%~18.38%;随着多糖浓度的增高,对抗体的抑制率也增高,呈浓度依赖性,相应其他22型多糖混合物对抗体的抑制率较低;线性R~2均0.99;2、9N、17F及20型肺炎链球菌荚膜多糖血清IgG抗体的检测限分别为0.630、0.592、0.478及0.594 ng/ml,检测范围分别为0.125~30.6、0.08~19.425、0.104~25.325及0.089~21.825 ng/ml。结论该方法具有良好的准确性、精密性及特异性,可用于肺炎球菌疫苗临床血清的检测。     

6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性

目的 制备6B型肺炎球菌荚膜多糖(6B-PNCPS)-破伤风类毒素蛋白(TT)结合疫苗,并研究其免疫原性。方法6B-PNCPS用溴化氰活化后与己二酰肼形成多糖-酰肼基衍生物,然后在蛋白活化剂碳二亚胺作用下将6B-PNCPS与TT进行共价结合。分别将其结合物及多糖免疫NIH小鼠,用ELISA检测小鼠血清中抗6B-PNCPS抗体。结果6B-PNCPS-TT结合物经凝胶色谱分析显示具有较6B-PNCPS更大的相对分子质量,多糖/蛋白比为1.42-1.66。结合物具有6B-PNCPS的血清学特异性,所诱生的抗6B-PNCPS特异性IgG抗体滴度与6B-PNCPS差异有显著意义。结论 用该法制备6B-PNCPS-TT结合疫苗,具有良好的免疫原性。     

22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化及其多糖蛋白结合物的免疫原性

目的用不同活化剂进行22F型肺炎球菌荚膜多糖(type 22F streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide)的活化,并探讨其多糖蛋白结合物的免疫原性。方法分别用溴化氰(cyanogen bromide,CNBr)和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)作为22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化剂,1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为链接剂,制备22F型肺炎荚膜多糖衍生物(3批Pn22FpsADH1和3批Pn22Fps-ADH2);在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的作用下,将衍生物与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)共价结合,经凝胶过滤柱层析纯化,得到22F型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物(3批Pn22Fps-TT1和3批Pn22Fps-TT2);并对其生化指标、血清学特异性、免疫原性及异常毒性进行检测。结果衍生物Pn22Fps-ADH2的衍生率及回收率均略高于Pn22Fps-ADH1;结合物Pn22Fps-TT2的生化指标检测结果相对Pn22Fps-TT1较好;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均可与22F型肺炎球菌诊断血清特异性结合;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均具有良好的免疫原性;无异常毒性。结论 CNBr和CDAP均可作为22F型肺炎球菌荚膜多糖活化剂,经活化和结合反应,其抗原位点得到较好保留,但CDAP作为结合疫苗多糖的活化试剂效果更佳。     

细菌多糖结合疫苗载体蛋白的免疫原性干扰作用

细菌多糖蛋白结合疫苗(b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌多糖结合疫苗)普遍用于2岁以下婴幼儿免疫。目前该类疫苗广泛使用的蛋白载体有破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、CRM19(7白喉毒素的一种突变体)和未分型流感嗜血杆菌蛋白D(nontypeable haemophilus influenzae protein D,PD)。本文就目前这类疫苗免疫接种中载体特异的T辅助细胞刺激作用、载体诱导的表位抑制作用(carrier-induced-epitopic suppression,CIES)和旁观者干扰效应进行初步探讨。     

肺炎链球菌DnaJ蛋白的原核表达及其免疫保护效果

目的原核表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40,DnaJ),并探讨其免疫保护效果。方法从2、3、6B、14、19F、R6型肺炎链球菌基因组DNA中扩增DnaJ基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-DnaJ,转化大肠埃西菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组DnaJ蛋白经Ni-NTA树脂纯化后,分别经腹腔和鼻黏膜免疫小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和唾液中特异性IgG和IgA抗体滴度;用重组蛋白刺激小鼠脾细胞,ELISA法检测细胞因子水平的变化;流式细胞术检测特异性抗DnaJ血清结合到肺炎链球菌表面的能力;检测抗DnaJ血清抑制R6型肺炎链球菌黏附A549细胞的能力。结果 6株肺炎链球菌的PCR扩增产物均可见1 119 bp的DnaJ基因片段,测序结果与GenBank中登录的序列一致;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;纯化的重组DnaJ蛋白相对分子质量约为38 000,纯度达90%以上,可与DnaJ小鼠免疫血清发生特异性反应。腹腔免疫DnaJ可使小鼠血清产生高滴度的特异性抗DnaJ抗体,鼻黏膜免疫DnaJ可增加小鼠血清和黏膜中抗DnaJ IgG和IgA抗体水平(P<0.01);鼻黏膜免疫DnaJ可使小鼠脾细胞释放高水平的细胞因子IL-10、IFNγ和IL-17A;抗DnaJ血清对肺炎链球菌具有更强的结合能力,且可抑制肺炎链球菌黏附肺癌上皮细胞A549。结论 DnaJ可诱导小鼠产生保护性免疫应答,提示其具有作为肺炎链球菌蛋白疫苗抗原的潜力。     

23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制

目的　研制 2 3价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗。方法　采用 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、2 0、2 2F、2 3F和 33F等 2 3型肺炎链球菌进行大罐培养和荚膜多糖的纯化 ,制备出 2 3价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗。结果　经检定其主要质量指标均符合欧洲药典 (1997年版 )要求。结论　已建立起较为成熟的培养及纯化工艺 ,具备了规模化的生产条件     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备

目的制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法经溴化氰(CNBr)分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼(ADH)的连接作用和碳二亚胺(EDAC)的偶联作用下,与破伤风类毒素(Tetanic toxoid,TT)形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT(P<0.01),结合物含量差异无统计学意义(P>0.05)。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。     

一维核磁共振氢谱法在肺炎链球菌多糖结合疫苗检定中的应用

目的 探讨一维核磁共振氢谱(one dimensional nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum,¹H-NMR)在肺炎链球菌多糖结合疫苗检定中的应用。方法 采用¹H-NMR法对9V、14、6A、11A型肺炎链球菌精制多糖、降解多糖、活化多糖、多糖衍生物、多糖结合原液进行结构表征,对比特征基团的结构差异。结果 9V、14、6A、11A型肺炎链球菌降解多糖、活化多糖、多糖衍生物及多糖结合原液与肺炎球链菌多糖标准品指纹区结构一致,表明肺炎链球菌多糖在降解、活化、衍生过程中多糖结构完整性未受影响。结论 ¹H-NMR法可用于肺炎链球菌多糖及其多糖降解、活化、衍生过程中的结构表征,该方法可有效地对肺炎链球菌多糖结合疫苗进行质量控制。     

A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。     

评价肺炎链球菌多糖结合疫苗效力的调理吞噬试验条件的优化

目的优化评价肺炎链球菌多糖结合疫苗效力的调理吞噬试验(Opsonophagocytic assay,OPA)的条件。方法参考美国阿拉巴马大学的WHO指定实验室于2007年1月发布的A.02版实验规程,优化OPA的试验条件。分别以抗性和非抗性肺炎链球菌菌株作为靶细菌检测其对应型结合物受试血清的调理吞噬效价后,再与相应的ELISA效价比较,分析二者的相关性。结果 0.8%二甲基甲酰胺(DMF)诱导HL-60细胞分化4d后,细胞表面标志表达量分别为:CD11b和CD35≥55%、CD71≤15%,活细胞比例≥65%;各型肺炎链球菌工作种子批的复活率≥80%;补体的非特异性杀伤率为18%;各血清型均表现出良好的杀菌活性,且OPA法与ELISA法测定的血清抗体效价比较,相关系数和斜率非常接近。结论优化的OPA条件符合该试验要求,可用于肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的效力评价。     

A群脑膜炎球菌多糖-重组蛋白Pep10结合物的制备及其免疫原性

目的制备A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)-重组蛋白Pep10结合物,并检测其免疫原性,探讨重组蛋白Pep10作为一种候选载体蛋白的可行性。方法GAMP经溴化氰(CNBr)活化后,共价接合己二酰肼(ADH)手臂,在碳二亚胺(EDAC)催化下与重组蛋白Pep10偶联,制备结合物GAMP-ADH-Pep10。纯化后免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP IgG抗体水平,并分析载体诱导的免疫抑制率。结果所制备的多糖衍生物GAMP-ADH及多糖-蛋白结合物GAMP-ADH-Pep10均具有GAMP抗原特异活性,免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,且接近GAMP-ADH-TT疫苗诱生的抗体水平,并能形成免疫记忆。重组蛋白Pep10诱导的免疫抑制率远低于TT诱导的免疫抑制率。结论制备的重组蛋白Pep10与A群脑膜炎球菌多糖偶联能发挥较强的载体效应,为研究理想载体蛋白提供了新的思路。     

响应面法优化14型肺炎链球菌荚膜多糖的超滤工艺

目的利用响应面法优化14型肺炎链球菌荚膜多糖的超滤工艺。方法选择跨膜压力、切向流量及多糖浓度为自变量,膜包处理能力为响应值,采用Box-Behnken设计分析各自变量及其交互作用对膜包处理能力的影响;利用Design Expert软件对数据进行回归分析,得到回归方程的预测模型,取3批14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液,对优化的工艺参数进行验证;按照最佳超滤工艺对3批14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液进行等体积透析,确定超滤终点;并对纯化的荚膜多糖进行各项检定。结果优化的14型肺炎链球菌荚膜多糖超滤工艺为:跨膜压力12.8 Psi,切向流量66 L/h,多糖浓度0.86 g/L,最适透析倍数为5倍,在该条件下,膜包处理能力的理论值为91.7 g/(h·m2),实际值为91.9 g/(h·m2)。3批纯化的14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液的多糖组分均符合《欧洲药典》7.0版相关规定,均未检出残余脱氧胆酸钠和乙醇,3批多糖的相对分子质量均大于420 000,抗原性良好,且抗原物质成分无差异。结论响应面法优化的14型肺炎链球菌荚膜多糖超滤工艺显著提高了工作效率,降低了生产成本,为14型肺炎链球菌荚膜多糖的规模化生产提供了实验依据。     

酸沉淀法纯化14血清型肺炎链球菌荚膜多糖工艺的建立

目的建立一种14血清型肺炎链球菌荚膜多糖的酸沉淀法纯化工艺,以替代传统的苯酚抽提法。方法对建立的14型肺炎链球菌荚膜多糖酸沉淀法中的氯化钙终浓度(0、50、100、200、400 mmol/L)、p H值(3.5、4.0、4.5、5.0及5.7)及反应时间(0、1、2、4、6、8 h及过夜)进行优化。采用优化后的方法纯化3批14型肺炎粗制多糖,制备精制多糖,并进行理化指标、抗原性检测及核磁分析,同时与苯酚抽提纯化工艺进行比较。结果酸沉淀法的最佳工艺为:氯化钙终浓度50~100 mmol/L,p H值3.5~4.0,作用时间为过夜。采用该方法制备的3批14型肺炎精制多糖的蛋白和核酸杂质含量均较低,总磷、总氮、氨基己糖含量、多糖分子质量均符合企业注册标准,抗原活性和核磁共振图谱的分析结果表明其多糖结构无异常。结论酸沉淀法具有操作简便、效果显著及不需使用有毒有害试剂等优点,可用于纯化14型肺炎链球菌荚膜多糖。     

C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备工艺的优化

目的优化C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)结合疫苗的制备工艺。方法分别采用衍化的降解多糖与TT结合、衍化TT与降解多糖结合和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶.四氟化硼(CDAP)活化降解多糖后衍化再与TT结合的方法制备C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物PSAH-TT、PS-AHTT和PSCDAPAH-TT,并进行生化指标和抗原性检测,与溴化氰(CNBr)活化多糖衍化与TT的结合物PSCNBrAH-TT进行免疫原性比较,确定最适制备工艺,并制备2批结合疫苗,与市售疫苗进行免疫原性比较。结果 3种方法制备的多糖蛋白结合物生化指标存在差异,以PSCDAPAH-TT收率最高,且均保持了多糖的抗原性及免疫原性,并有免疫加强效应;PSCDAPAH-TT免疫2针后抗体GMT水平高于PSAH-TT和PS-AHTT,差异有统计学意义(P<0.05),3针后抗体GMT水平仍高于PSAH-TT和PS-AHTT,但差异无统计学意义(P>0.05),PSCDAPAH-TT免疫2针和3针后抗体GMT水平均高于PSCNBrAH-TT,且2针后差异有统计学意义(P<0.05),3针后差异也无统计学意义(P>0.05),但制备的2批PSCDAPAH-TT疫苗免疫2针和3针后的抗体GMT水平均明显高于市售疫苗,差异有统计学意义(P<0.05)。结论经CDAP活化降解多糖后衍化再与载体蛋白结合制备的疫苗具有较好的免疫原性。     

B群脑膜炎奈瑟菌疫苗的研究进展

随着A、C、W135、Y群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides,Nm)多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的接种使用,相应菌群引起的流行性脑膜炎的发病率和死亡率均得到有效控制,而B群等其他群别引起的流行性脑膜炎发病率有所增加。因B群Nm的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)或多糖-蛋白结合物免疫原性均较低,目前采用常规方法尚未生产出有效的B群Nm疫苗。本文对B群Nm CPS疫苗、外膜囊泡(Out membrane vesicles,OMV)疫苗、脂寡糖(Lipooligosaccharide,LOS)疫苗和重组蛋白疫苗的研究进展作一综述。