外源DNA通过花粉管通道法导入玉米的研究

利用花粉管通道技术,以抗虫的胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)为供体,以8个品种玉米为受体,进行外源DNA直接导入,获得了大量的转基因植株,通过对抗性植株的初步分子鉴定,证实外源CpTI基因存在并整合入玉米基因组中。     

农杆菌介导法获得抗病毒病转基因大白菜

为获得抗芜菁花叶病毒病的大白菜植株,用携带TuMV-cp基因的农杆菌R1000和EHA105转化大白菜子叶和下胚轴,PCR、PCR-Southern检测证实TuMV-cp基因已导入并整合到大白菜的基因组中.RT-PCR检测表明TuMV-cp在转录水平上获得了稳定表达.TuMV-cp基因在转基因植株T1代中获得了稳定的遗传.抗病性鉴定结果表明转基因植株T1代较非转基因植株对TuMV的抗性增强,获得了抗病毒病的转基因大白菜植株.     

籼型杂交水稻保持系IR58025B pin2转基因植株

杂交水稻技术在中国及其他国家已作为发展水稻生产,满足不断增加的人口对粮食需要的一条关键途径．而另一方面,据估计因螟虫危害造成水稻年均损失为5％～10％,有时高达60％～95％．应用马铃薯蛋白酶抑制剂基因(potato proteinase inhibitor Ⅱor pin2)进行粳稻的遗传转化实验表明,其转基因粳稻植株对螟虫的抗性显著提高,且该转基因能在后代中稳定遗传(Duan et al．,1996)．为了改良杂交水稻对螟虫的抗性,以大面积应用的籼型杂交稻保持系IR58025B成熟胚为外植体材料、以pin为目的基因、通过基因枪法高效获得了大量转基因植株．PCR检测结果表明转基因pin2成功地整合于植株基因组中．三化螟幼虫饲喂试验结果初步证实了该转基因在转基因当代植株中的表达．     

DNA高效转染CHO细胞的研究

为了获得外源基因在CHO细胞中的高效瞬时表达，本实验对比研究了常用转染方法转染CHO细胞的效果，并采用单因素分析方法优化了在本实验条件下转染效果较好的Lipofectine转染方法。获得了外源基因在CHO细胞中的高效瞬时表达结果，为外源基因表达产物的功能研究制造了条件。，     

八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体的构建及对人参的遗传转化

将八氢番茄红素合成酶基因重组于植物双元表达载体pBin438,得到重组质粒pBin438PSY.用冻融法将其导入农杆菌EHA101中,采用叶盘法转化人参愈伤组织,经诱导与筛选,获得了潮霉素抗性植株。提取抗性植株总DNA,通过PCR扩增和PCR-Southern杂交检测,筛选出了整合有外源基因的抗性细胞系。为进一步研究八氢番茄红素合成酶基因在人参中的表达及生物学功能的研究奠定了基础。     

影响农杆菌介导植物遗传转化的因素

农杆菌介导的基因转化是一种使外源DNA转移到目的植株的天然系统，通过植物表达载体上DNA的加工与转移将外源DNA转运到植物细胞中的转基因方法．介绍了该方法在转化过程中的影响因素，包括转基因受体、外源基因供体、共培养条件、植物培养基的成分和外植体培养条件等．     

影响农杆菌介导植物遗传转化的因素

农杆菌介导的基因转化是一种使外源DNA转移到目的植株的天然系统,通过植物表达载体上DNA的加工与转移将外源DNA转运到植物细胞中的转基因方法.介绍了该方法在转化过程中的影响因素,包括转基因受体、外源基因供体、共培养条件、植物培养基的成分和外植体培养条件等.     

两种不同选择标记的转化效率比较

为了弄清两个选择标记在相同条件下的转化效率,为转基因选择遗传标记时提供参考,以优良恢复系明恢63为受体材料,采用农杆菌介导的遗传转化法,分别以hpt和bar基因为选择标记进行了转化.结果显示:1 500块胚性愈伤共培养后获得214块抗性愈伤,转化效率为14.3%;5 400块胚性愈伤共培养后获得156块抗性愈伤,转化效率为2.9%;两者的分化率分别为79.0%和80.7%.此外,以hpt和bar为选择标记,从胚性愈伤诱导到获得转基因植株分别需要75天和125天.因此,以hpt为选择标记的遗传转化,比较适合基因功能验证和共培养培育无选择标记水稻植株;如果是培育商品化的转基因水稻植株,则最好以bar为选择标记基因.     

两种不同选择标记的转化效率比较

为了弄清两个选择标记在相同条件下的转化效率,为转基因选择遗传标记时提供参考,以优良恢复系明恢63为受体材料,采用农杆菌介导的遗传转化法,分别以hpt和bar基因为选择标记进行了转化．结果显示：1500块胚性愈伤共培养后获得214块抗性愈伤,转化效率为14．3％;5400块胚性愈伤共培养后获得156块抗性愈伤,转化效率为2．9％;两者的分化率分别为79．0％和80．7％．此外,以hpt和bar为选择标记,从胚性愈伤诱导到获得转基因植株分别需要75天和125天．因此,以hpt为选择标记的遗传转化,比较适合基因功能验证和共培养培育无选择标记水稻植株;如果是培育商品化的转基因水稻植株,则最好以bar为选择标记基因．     

干旱胁迫下外源钙对矿区玉米生长的影响

通过盆栽模拟试验,以玉米为供试植物,矿区退化土壤为供试基质,对盆栽玉米分别施加不同浓度的CaCl2(5,10,20,40,80mmol/L),研究了干旱胁迫下外源钙对矿区玉米生长和养分吸收的影响.结果表明:对矿区退化土壤上生长的玉米施加适当含量的外源钙,可显著提高玉米对养分的吸收,有利于玉米的生长.当施入CaCl2浓度小于20mmol/L时,玉米氮磷钾累积量随外源钙含量的增加而增加,且用浓度为20mmol/L的CaCl2处理显著提高了苗期玉米的生物量、叶片相对含水量和叶片叶色值(SPAD),玉米地上部分和根系部分氮磷钾累积量与其它处理差异性显著;当施入CaCl2浓度大于40mmol/L时,玉米氮磷钾累积量随着外源钙含量增加而降低;用浓度为80mmol/L的CaCl2处理抑制了玉米的生长,高含量的钙破坏了玉米离子动态平衡,对苗期玉米生长产生危害.     

玉米花粉发育过程中线粒体nad4基因的转录规律

以玉米花粉为材料,提取总RNA后通过定量斑点杂交技术研究花粉发育过程中线粒体nad4基因的转录规律.结果表明,在幼叶及不同发育时期的花粉中,线粒体nad4基因的转录不存在其他线粒体基因那样的高度时空特异性,而是表现出等量转录规律.因此我们认为花粉发育过程中线粒体基因的转录随基因种类、组织种类及植物种类而不同,或表现时空特异性,或表现稳定的转录规律,同时对玉米不同发育阶段花粉总RNA的分离技术进行了研究.     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

核苷酸转移酶与玉米非生物胁迫响应

核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase protein,NTP)能够对RNA 3'末端进行修饰,从而影响其稳定性.通过分析玉米NTP蛋白家族的结构域与拟南芥、水稻中NTP蛋白进化的关系,发现玉米中含有24种NTP基因,并且玉米、拟南芥和水稻3种植物中的NTP基因具有高度同源性与保守性.对玉米NTP基因启动子上游顺式作用元件进行预测分析,结果显示,玉米NTP基因启动子中含有多个与非生物胁迫相关的启动子元件.通过反转录聚合酶链式反应分析在高盐、干旱、植物激素脱落酸的非生物胁迫条件下,玉米NTP相关基因的表达量,研究发现,玉米NTP基因能被非生物胁迫诱导表达.实验表明玉米NTP基因与非生物胁迫相关,且可能参与了植株抵抗逆境胁迫的过程.     

经密码子优化的葡萄糖醛酸酶在E．coli中的表达

对α-葡萄糖醛酸酶基因(AguA)的稀有密码子进行了优化，经过稀有密码子优化的基因在pTrc99A载体中由于二级结构稳定性的增加使得目的基因的表达水平比原始基因还要低，在权衡几个栽体后使用本实验室构建的热激载体pAT，可以降低mRNA二级结构自由能(△g)，得到了α-葡萄糖醛酸酶的高表达，结果充分说明了mRNA二级结构的自由能对外源基因的表达的影响。     

离子注入在生物工程上的应用

本文介绍了离子注入在生物工程上的应用．报道了离子束生物技术应用于生物品种改良和外源基因转移所取得的成果,及我们近期所研究的与此相关的其他成果．     

信号肽引导源基因在昆虫表达系统中的分泌表达

将杆状病来源的gp67信号肽引导的慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因与植物来源的慈姑蛋白酶抑制剂信号肽引导的慈姑蛋白抑制剂(API)基因，分别克隆到昆虫杆状病毒转载体pBacPAK8中，通过共转染将它们分别整合到昆虫病毒表达载体Bm—BacPAK6中，将获得的重组病毒CrBK—API2和CrBK—bpAPI4分别接种家蚕(Bombyx mori)细胞、家蚕幼虫及蛹体中，慈姑蛋白酶抑制剂得到了高效表达。从家蚕细胞的表达来看，外源表达产物大多存在于细胞外的上清液中；从家蚕幼虫体内表达来看，信号肽能引导外源基因高效表达，且表达产物的90％以上能分泌到细胞外；蛹体中的表达情况与幼虫中的相似，但表达产物出了不均一的现象，从表达产物的分子量测定来看，这两种信号肽在表达过程中都没有被切除。     

RAPD分子标记对高粱DNA经花粉管导入玉米自交系的验证

采用SDS方法纯化高粱总DNA,通过花粉管通道将高粱DNA转化P138、丹改340、7922、06NY-2、组3等5个品种的玉米自交系,后代的玉米种子经随机筛选后在实验室盆栽得到幼苗。使用不同序列的59条RAPD引物,对高梁基因组DNA和导入前后的玉米基因组总DNA进行PCR扩增。结果表明,其中9条引物在后代玉米和玉米原种之间具有RAPD差异,并证明了高梁DNA导入了4个玉米自交系,为今后的玉米自交系花粉管导入法育种的分子检验奠定了基础。     

MPCR方法检测转Bt基因玉米背景的研究

对玉米的转Bt基因背景进行了MPCR分子检测和普通PCR方法检测,两者检测结果一致.     

SYBR Green实时定量PCR检测外源基因拷贝数

以SYBR Green为荧光染料,通过携带双基因GFP和IL-24的质粒标准品绘制双标准曲线,并以绝对定量的方法检测GFP在稳定细胞株Hela-GFP基因组中的整合拷贝数。结果证实,该方法能有效检测外源基因在基因组上的整合拷贝数。从而建立起一种高效且廉价的检测外源基因拷贝数的通用方法来广泛应用于各种实验。     

HBV S/HEV ORF2融合基因对番茄的遗传转化

应用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在戊肝病毒(HEV)ORF2部分序列的5′端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成融合基因BE。将融合基因BE克隆到植物双元表达载体pBin438上,获得pBin438BE,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,侵染丽春番茄子叶和下胚轴,经预培养、共培养、筛选培养、生根培养获得了5株抗卡那霉素的番茄植株。提取抗性植株基因组DNA,进行PCR及PCR-Southern检测,4株获得阳性信号。初步表明目的基因已整合到了番茄基因组中。