感染神经元内流行性出血热病毒抗原的免疫金标记

在所有的RNA病毒中,布尼安病毒科(Family Bunyaviridae)的病毒是唯一的具有在感染细胞高尔基复合体及其邻近光面囊泡内芽生成熟的形态发生学特征。我们曾应用常规超薄切片电镜技术,在我国两种出血热(流行性出血热,EHF和新疆出血热,XHF)病毒感染的新生乳鼠大脑海马回神经元内观察到病毒在增生、扩张的高尔基扁囊和囊泡内芽生成熟的图象。本研究应用低温包埋免疫金标记技术进行感染细胞内EHF病毒抗原分子的亚细胞定位,以求阐明高尔基复合体异常增生与病毒抗原分布的关系。     

病毒免疫电子显微学金标记技术的建立

有关金标记技术在病毒学中的应用,国内外已有报道。但迄今为止,未见有将该技术同时应用于液体样品及感染细胞内病毒抗原际记,并对各种不同实验条件下进行对比研究的报道。本研究将金标记技术同时应用于液体样品及感染细胞中脊髓灰质炎、猴轮状病毒、SV_(40)和单纯疱疹等病毒抗原的标记。对反应物混合标记同悬浮标记、低温包埋标记同常觇包埋标记法以及标记条件、反应物浓度等不同实验条件进行了摸索,比较了不同实验方法和条件标记的结果。目的在于建立一种稳定的,可用于多种病毒检测的方法。液体样品阴性染色标记结果表明,反应物混合标记明显优于悬浮法。实验中,只要控制好琼脂扩散时间,注     

介绍一种新的复合免疫标记技术（光镜荧光免疫标记结合电镜免疫金标记）

介绍一种新的复合免疫标记技术（光镜荧光免疫标记结合电镜免疫金标记）陆月良，夏愿耀，颜永碧（第二军医大学中心实验室，上海２００４３３）本方法将荧光免疫标记与免疫金标记技术二者相结合，使同一份样品能在荧光显微镜下观察，也可以进行电镜观察。我们采用这项技术...     

植物钙调素的免疫金标记电镜技术

本文用玉米根尖作为实验材料,建立了植物钙调素免疫胶体全电镜定位技术。采用Epon812常规包埋方法;以脱脂奶粉作为封闭试剂;用过碘酸钠处理切片,使之恢复抗原性。所用的兔抗小麦钙调素抗体对植物钙调素具有较高的亲和力和专一性。本方法具有操作方便。标记特异性较强,超微结构保存较好等特点。     

免疫毒素细胞内传递途径的免疫金双标记研究

应用免疫金双标记技术对免疫毒素在细胞内传递途径进行了亚显微形态研究。采用5nm胶体金颗粒标记羊抗鼠、15nm胶体金颗粒标记兔抗蓖麻毒素以及免疫毒素(由抗CD_5、CD_2、CD_8及抗金T细胞的单抗DS27、JN205、P218、P81和蓖麻毒素构成),对免疫毒素与Molt-4细胞(人T淋巴细胞系)的相互作用进行了动态观察及超微结构定位。电镜下,在不同时期的实验动态观察中,两种不同粒径的金颗粒相伴随,共同定位于细胞膜及其突起表面、细胞膜被膜小凹(Coated pit)中,随后进入细胞内,定位于内吞小体(endosome)及其所属小管、小泡、多泡小体及溶酶体,并迅速到达跨高尔基氏复合体网状系统(trans-Golgi network)。实验中还观察到细胞膜表面有分布     

辛德毕斯病毒囊膜蛋白的免疫标记

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,简称SbV)是最小的有囊膜的RNA病毒之一(图1),其囊幕含有二种病毒特异的囊膜蛋白(图1箭头)。病毒囊膜蛋白是在宿主细胞粗面内质网上合成的,经高尔基体加工后转运到细胞质膜上。研究SbV囊膜蛋白在细胞膜上的分布有助于进一步了解病毒的成熟与释放过程及其机制。我们曾参照P.Pinto da Silva的方法用抗病毒囊膜蛋白的抗体对SbV感染的细胞进行胶体金免疫标记,然后制备冰冻断裂复型样品,获得了宿主细胞质膜EF面复型与ES面的标记金颗粒的叠加图象(图2),进而我们探索了标记一复型技术和获得PF面复型与PS面标记金颗粒的叠加图象的方法,前者更有效地显示SbV囊膜蛋白在细胞质膜上的分布(图3),后者则可以把细胞内的免疫标记与冰冻蚀刻技术相结合,以对膜内微粒中的SbV囊膜蛋白进行定性定位的研究(图4),从而在一定程度上弥补了P.Pintoda Silva方法的不足。     

流行性出血热病人肝脏改变的超微结构观察

流行性出血热病毒主要在肾、脑和肺等组织检出,近年来,也有报告可在肝脏组织中检出。1987年前后,国内外相续报告了流行性出血热累及肝脏的临床病例,但有关肝脏受累的病理改变报告甚少,超微结构尚无报告。本文观察了9例临床确诊为流行性出血热患者的肝穿刺标本。9例患者均有肝脏受累的临床表现和血清酶学检查。标本采取在发病的第13—27天之间,均为恢复期。     

流行性出血热病人外周血细胞感染病毒的形态学证据

在流行性出血热(EHF)病人外周血大单核细胞内应用免疫荧光法可以检测到EHF相关抗原,也能分离到EHF病毒。但尚未见到有从外周血细胞中直接检出EHF病毒的报导。本文应用透射电镜在复查所采集的7例EHF早期病人外周血细胞的超薄切片中发现两例血样品的单个核细胞中含病毒颗粒。EHF病人血细胞胞浆内所查见的病毒颗粒呈园形或卵园形,有包膜,包膜表面微突不完全,毒粒直径大小差异较大,大的在110—160nm,小的仅60nm,有的病毒还带有小尾(图1—     

病毒感染单层细胞的免疫标记与断裂技术

用抗Sindbis病毒(SbV)囊膜蛋白E_1和E_2的抗体及抗Vesicular Stomatitis病毒(VSV)囊膜蛋白(G蛋白)的抗体分别对病毒感染的BHK-21细胞进行胶体金免疫标记,然后按冰冻蚀刻的制样程序制备铂-碳复型膜以研究病毒囊膜蛋白在细胞质膜上的定位与分布。本文扼要地介绍了这一技术的操作过程,同时,结合我们自己的工作对该技术的要点及其应用进行了讨论。     

免疫胶体金标记牛小肠碱性磷酸酶的研究

酶在细胞超微结构上的定位,通常是用细胞化学的方法,根据其底物的特异性通过重金属元素进行标记定位;而对于某些底物特异性较差的酶和同工酶在免疫化学上不同时,应用免疫组织学的方法以其抗原——抗体反应的高度特异性为基础,对酶进行定位研究确是一种有力的手段。特别是应用近几年发展起来的免疫胶体金技术对酶进行定位研究,可以得到高分辩率、高特异性的标记,并可对同一细胞内的不同酶的存在进行双重和多重标记。     

福氏2a痢疾杆菌膜抗原的免疫电镜定位

本文报告应用抗福氏2a痢疾杆菌膜成份McAb及胶体金探针对细菌膜抗原进行了定位。结果显示4种抗脂多糖McAb(3A6、2E6、4F1、2A3)可不均一的识别位于细菌壁表面的抗原,而另外一种抗LPS的McAb种(1G8)和一种抗膜蛋白McAb(1A1)识别的抗原未暴露于细菌表面。应用细菌膜碎片包埋前染色成功定位了抗膜蛋白McAb(1A1)位于细菌内膜的抗原。与McAb的生物活性比较表明阳性标记细菌表面抗原的McAb的抗原与其阻段志贺氏菌接触性溶血试验和对小鼠的被动保护力密切相关。提示免疫电镜标记技术确定LPS抗原表位在细菌表面的可及性和拷贝数对构建和筛选痢疾工程菌苗具有重要意义。     

细胞内病毒抗原定位的低温包埋及胶体金标记

本文报告使用低温包埋剂Lowicryl K4M对感染细胞进行低温包埋和制作超薄切片,用包被SPA或IgG的胶体金作为第二抗体,采用间接法对两种RNA病毒(脊髓灰质炎病毒和轮状病毒)和两种DNA病毒(单纯疱疹Ⅰ型病毒及SV_(40))在感染细胞中作了定位标记实验。将结果同常规环氧树脂Epon 812包埋的感染细胞包埋前穿透标记和包埋后超薄切片标记进行比较。常规包埋法对细胞超微结构保存良好,但由于高温聚合对病毒抗原活性破坏较大,不能获得理想的金标记结果。使用皂角甙(Saponin)改变细胞膜进行包埋前穿透标记,虽能获得特异性标记,但皂角甙对细胞膜结构破坏严重,不利于进行病毒与细胞相互作用关系的研究,且作用条件及时间不易掌握。以上缺点可通过使用低温包埋法得到解决。     

微波辐射固定及其在免疫金标记技术中的应用

应用微波辐射快速固定大鼠胰腺组织和白血病病人骨髓细胞悬液,再按常规制作电镜超薄切片。包埋后超薄切片免疫金标记β细胞中的胰岛素分泌颗粒显示组织细胞结构清晰,标记率高,(图1)。骨髓细胞悬液包埋前免疫金标记和酶反应定位血小板表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)和胞浆内过氧化物酶均呈现阳性结果(图2)。电镜观察结果表明,经微波辐射固定的生物样品能较好地保存细胞的超微结构,抗原性及其酶活性。根据多次反复试验,我们取得的经验是,在进行微波辐射固定生物样品时,电镜样品固定温度和时间以26～28℃,15秒为宜。由于微波辐射加热温度升高很快,我们采用在炉室内四角放置四个盛有     

C3和C4植物叶细胞中Rubisco和RCA的免疫金标记定位

Rubisco(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶)是植物进行光合碳同化的关键酶,它参与了光合作用碳固定和光呼吸碳氧化过程,调节两者之间的相对比例,其含量和活性与光合速率密切相关。RCA(Rubisco活化酶)是近年发现的一种可以调节Rubisco活性的酶,能使Rubisco在植株体内条件下     

免疫复合物引起实验动物组织细胞中脂褐素变化的电镜观察

流行性出血热患者脑组织血管外常有大量含脂褐素颗粒的吞噬细胞[1] ,并发现流行性出血热患者脑组织的许多神经细胞和神经胶质细胞都含有脂褐素颗粒[2 ] 。我们用ＨＦＲＳ病毒抗原和相应抗体在体外制备成可溶性免疫复合物 (ＩＣ ) ,注射到正常ＢＬＡＢ Ｃ小鼠体内 ,已经证明可溶性ＩＣ对小鼠有致病变作用[3 ,4] ,但注射ＩＣ后 ,动物组织细胞中脂褐素颗粒的变化情况还未见报道。本实验采用电子显微镜观察了脂褐素在实验动物肝脏和肾脏的组织分布及其亚微结构改变。材料和方法本实验所用动物为健康的雄性ＢＡＬＢ ｃ小鼠 2 0只 ,8周龄 ,体重 2 …     

肾综合征出血热发病中不溶性免疫复合物的作用

目的：为确定肾综合征出血热（HFRS）不溶性免疫复合物（IC）在发病中的作用。方法：本研究采用HFRS病毒抗原和相应抗体在体外制备成特异性的不溶性IC,经尾静脉注射入小鼠体内,而后应用免疫荧光组织化学方法结合激光扫描共聚焦显微镜和电子显微镜观察了病毒抗原及IC在各主要脏器的分布及其致病变作用。结果：IC注射后24h,主要见于血管系统如肝血窦和肾小球毛细血管之中。IC注射72h后,IC主要存在于肾小球基底膜部位以及血管系膜中,呈细小或粗大的颗粒状。肾小球毛细血管中红细胞明确阳性。某些血管腔中仍充满荧光物质,有些荧光物质位于足细胞的胞质内。在肾小球周围的部分肾小管上皮细胞可有IC,包括抗原和C3。不溶性IC注射后168h（7d）,大多数肾小球结构接近正常,几乎看不到特异性的荧光。电镜观察发现病变以肾小球为主,发现系膜细胞伸出明显的胞质突起,并延伸至内皮和基膜之间。系膜细胞也有增生,可见沿细胞膜分布的中等数量的吞饮小泡以及胞浆中小的溶酶体颗粒。免疫沉积物可出现在肾小球系膜基质区,为不规则形,常聚集成团块状,呈散在分布,有时可见于内皮下、上皮下和/或基膜内。肾小球基膜呈不规则延伸、增厚,呈花斑状,并形成裂隙。IC注射后24h,某些毛细血管袢管腔中有血小板聚集。注射后72h,血小板聚集已不明显。某些毛细血管内皮细胞损伤严重,内皮细胞肿胀,部分区域内皮细胞突起脱落,基膜裸露。内皮细胞伸出许多绒毛状突起,互相交织融合形成拱状结构。胞浆中游离核糖体和粗面内质网增多。有些内皮细胞的胞质形成泡状结构。毛细血管管腔中充满一些电子致密的沉积物,并且这些电子致密物可通过内皮缺损与肾小球毛细血管基膜物质相连。肾小球囊壁层基膜外侧裸露,有胶原纤维形成。足细胞肿胀,突起融     

DGD包埋—去包埋样品的免疫标记

小鼠膀胱上皮细胞经细胞选择性抽提和ＤＧＤ包埋后，制备超薄切片，并对其进行免疫标记。结果表明，ＤＧＤ包埋－去包埋样品中的ＡＵＭ蛋白仍可特异地被抗体所识别，这一结果为证明小鼠膀胱上皮细胞中由ＡＵＭ蛋白组成的梭形泡以及腔面不对称单位膜结构均与中间纤维相连提高了证据。本文还对ＤＧＤ包埋后样品免疫标记技术进行了讨论。     

基于聚硫堇修饰金电极构建无标记电流型免疫传感器检测冈田酸

在金电极表面利用循环伏安法电聚合修饰聚硫堇(PTh),由于PTh表面具有大量的-NH2官能团,可通过与戊二醛发生席夫碱反应固定抗体,基于抗原-抗体特异性免疫反应的原理,构建一种无标记电流型免疫传感器,实现对冈田酸(OA)的定量检测。用该免疫传感器以方波伏安法(SWV)对OA浓度进行检测,在0.1～100μg/L范围内,免疫反应前后峰值电流差值?i_p与OA浓度对数值lgCOA具有良好的线性关系,线性回归方程为?i_p=4.1915+2.1679lgCOA,线性相关系数R²=0.9578,检测限为18.1 ng/L(S/N=3)。该传感器检测限低、线性工作区间宽、操作简便。