中间球海胆smad2/3基因克隆、组织表达及其脂多糖刺激响应

为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius smad2/3基因(命名为Si-smad2/3)信息,初步研究了该基因的序列特征、组织表达模式及脂多糖对其表达的影响,采用RACE技术克隆获得了成体中间球海胆Si-smad2/3基因的全长cDNA序列。结果表明:Si-smad2/3基因的cDNA全长为2146 bp,共编码446个氨基酸;生物信息学分析发现,Si-smad2/3基因所编码的蛋白相对分子质量为50 300,等电点为6.93,属于亲水性非跨膜蛋白;通过与9种已公布物种的smad2/3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化分析发现,中间球海胆Si-smad2/3蛋白的氨基酸序列与其他真核生物smad2/3蛋白序列具有较高的相似性,与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus smad2/3蛋白的一致性高达96%,符合中间球海胆的分类和进化地位;实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,Si-smad2/3基因在中间球海胆不同组织中均有表达,其相对表达量从高到低为体腔细胞>管足>性腺>围口膜>肠>齿间肌;利用脂多糖(LPS,0.1 mg/mL)对中间球海胆进行免疫刺激发现,与对照组相比,LPS刺激后Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞、管足和围口膜中均呈先升高后降低的表达趋势,其中,Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞中的相对表达量在LPS刺激9 h时达到峰值,管足中表达量在LPS刺激6 h时达到峰值,而围口膜中的表达量在LPS刺激72 h时达到峰值。研究表明,Si-smad2/3可能参与中间球海胆的免疫应答过程且免疫响应具有组织特异性。     

中间球海胆smad2/3基因克隆、组织表达及其脂多糖刺激响应

为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius smad2/3基因(命名为Si-smad2/3)信息,初步研究了该基因的序列特征、组织表达模式及脂多糖对其表达的影响,采用RACE技术克隆获得了成体中间球海胆Si-smad2/3基因的全长cDNA序列。结果表明:Si-smad2/3基因的cDNA全长为2146 bp,共编码446个氨基酸;生物信息学分析发现,Si-smad2/3基因所编码的蛋白相对分子质量为50 300,等电点为6.93,属于亲水性非跨膜蛋白;通过与9种已公布物种的smad2/3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化分析发现,中间球海胆Si-smad2/3蛋白的氨基酸序列与其他真核生物smad2/3蛋白序列具有较高的相似性,与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus smad2/3蛋白的一致性高达96%,符合中间球海胆的分类和进化地位;实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,Si-smad2/3基因在中间球海胆不同组织中均有表达,其相对表达量从高到低为体腔细胞>管足>性腺>围口膜>肠>齿间肌;利用脂多糖(LPS,0.1 mg/mL)对中间球海胆进行免疫刺激发现,与对照组相比,LPS刺激后Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞、管足和围口膜中均呈先升高后降低的表达趋势,其中,Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞中的相对表达量在LPS刺激9 h时达到峰值,管足中表达量在LPS刺激6 h时达到峰值,而围口膜中的表达量在LPS刺激72 h时达到峰值。研究表明,Si-smad2/3可能参与中间球海胆的免疫应答过程且免疫响应具有组织特异性。     

H_2O_2对家蚕抗菌肽表达水平的影响

抗菌肽是昆虫免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体的防御性多肽,具有分子量小、理化性能稳定和广谱抗菌的特性。为探索H2O2对家蚕抗菌肽表达水平的影响,本文利用半定量RT-PCR技术,通过给5龄第3天的家蚕幼虫注射外源H2O2,检测脂肪体组织中的6种抗菌肽在注射后6、12、24和48h4个不同时间点的转录表达情况。结果显示,与对照相比,6种抗菌肽在注射H2O2后均有不同程度转录表达,表明H2O2能够有效地诱导抗菌肽基因的表达,对家蚕抗菌肽的产生具有调控作用。     

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa¹75aa)和CARP(65aa175aa)和CARP(65aa¹02aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%⁵3%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。     

用链球菌疫苗免疫罗非鱼前后其差异表达基因的鉴定与分析

采用抑制性差减杂交技术(SSH)成功构建了罗非鱼O reochrom is nilotica被链球菌Streptococcus iniae疫苗免疫前后正、反两个淋巴细胞cDNA差减文库,富集了免疫过程中表达谱发生变化的淋巴细胞基因,并对文库进行了斑点杂交筛选、测序和ESTs初步分析。结果表明:文库富集了高丰度的差异表达基因,阳性率较高。正向文库中筛选得到21个免疫期间表达丰度上调的基因,其中1个基因与罗非鱼已知基因具有相似性,10个基因与其他鱼类已知基因相似,1个基因与其他物种已知基因具有相似性,9个为未知新基因;负向文库中筛选得到24个免疫期间表达丰度下调的基因,其中3个与罗非鱼已知基因具有相似性,15个与其他鱼类已知基因相似,6个为未知新基因。进一步功能注解发现,正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白、防御相关蛋白、肿瘤免疫相关蛋白和淋巴细胞相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度升高,提高了机体免疫抵抗力。负向文库功能基因包括细胞免疫相关蛋白、感染相关蛋白和肿瘤发生相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度降低,可以降低机体感染和发病几率。     

重组角质细胞生长因子-1在杆状病毒表达系统中的表达及其生物活性研究

目的:利用杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)表达重组角质细胞生长因子-1(KGF-1),并对其进行鉴定纯化及活性测定。方法:PCR扩增角质细胞生长因子-1基因(KGF-1)序列,克隆到pFastBac杆状病毒转座载体,经酶切测序鉴定出阳性重组转座载体pFastBac-kgf1后,转化含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选出阳性质粒Bacmid-kgf1,转染Spodoptera frugiperda(sf9)昆虫细胞。对收获的蛋白进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定。利用肝素亲和层析柱和阳离子交换柱对目的蛋白进行纯化,BaF3细胞检测细胞增殖活性,并利用C57BL/6小鼠检测促毛囊增殖活性。结果:分子量约21 kDa的KGF-1在昆虫细胞中实现了表达。病毒侵染细胞48 h时开始表达目的蛋白,到96 h时表达量达到最高;且感染复数multiplicity of infection(MOI)为4时表达量较好。经过纯化之后,蛋白纯度达到90%以上,蛋白产量达2 mg/L。纯化之后的蛋白对转染FGFR2Ⅲb的BaF3细胞在0.10 ng/ml-1.56 ng/ml之间有促增殖活性,呈剂量依赖关系。并且KGF-1处理后小鼠毛囊增殖效果有所加强。     

牦牛DIO2基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

为探索DIO2基因调控牦牛骨骼肌发育及肌纤维类型组成的潜在功能,克隆DIO2基因CDS序列并进行相关的生物信息学分析,以及比较分析其在牦牛骨骼肌的差异表达.结果显示,DIO2基因的CDS全长为789 bp,编码132个氨基酸.序列同源性比对及系统进化树分析发现,牦牛DIO2基因与普通牛的亲缘关系最近,核酸及蛋白序列与普通牛一致;与小鼠的亲缘关系较远,序列同源性仅为86.75%和87.12%,与原鸡的亲缘关系最远,二者的同源性分别为79.17%和76.30%.理化性质预测表明DIO2蛋白为不稳定疏水性蛋白,有跨膜结构域,具有24个磷酸化位点,蛋白结构为无规则卷曲、α-螺旋和延伸链三者交替出现.采用实时荧光定量PCR分析显示,DIO2基因在牦牛的脾、肺等内脏组织表达无显著差异;在背最长肌和半腱肌的表达量显著高于脂肪和肝脏组织(P<0.01).此外,DIO2在金川牦牛半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛(P<0.05).以上结果为研究DIO2在牦牛骨骼肌的功能提供参考资料.     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明:双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5'端非编码区,261 bp 3'端非翻译区和453 bp开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15 249 900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

仿刺参体壁创伤修复消减文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH),构建了仿刺参Apostichopus japonicus(体质量为65～90 g)正常体壁及创伤修复(24、48、72、96、120 h后)体壁的消减cDNA文库,利用PCR和斑点杂交技术对文库进行筛选,随机挑取的768个克隆中发现292个阳性克隆,对其中信号强度较强的224个阳性克隆进行测序,得到208个有效EST序列。经BlastX工具对获得的EST与GenBank数据库进行比对分析,结果有171个EST序列与数据库中的基因同源(e≤0.001,相似性>40%),其中153个为未知基因,18个为已知功能或已命名基因,包括在创伤及修复的体壁中上调表达的β微管蛋白、微管蛋白α-1链、肌动蛋白、肌动蛋白ike 7B类似物、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、tRNA假尿苷合成酶A、GTP酶、细胞分裂周期2类似蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶、homeobox蛋白、延伸因子1A、核糖体蛋白L30、核糖体蛋白L17、60S酸性核糖体蛋白P0、26S蛋白酶调节亚基、泛素特异性肽酶24、大肠癌血清抗原3、清道夫受体蛋白12等。本研究结果可为探讨刺参体壁再生过程和分子机理,以及筛选刺参体壁创伤修复过程中相关功能基因的研究提供基础依据。     

沙眼衣原体假定蛋白CT389原核表达质粒的构建及结构预测

目的构建能表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)假定蛋白CT389的质粒pGEX6P-ct389及预测其结构。方法设计特异性引物,以Ct基因组为模板,PCR法扩增ct389基因,构建携带目的基因的重组质粒pGEX6Pct389;通过PCR鉴定和双酶切鉴定初筛,测序鉴定验证结果;比较ct389和tc0668基因序列及其编码产物的相似性,采用生物信息学预测CT389蛋白的二级结构和三级结构。结果获得大小约为1 300 bp的ct389基因片段,并成功得到重组质粒pGEX6P-ct389。ct389和tc0668基因及其编码产物的相似性高达84%和92%,CT389蛋白α-螺旋、无规卷曲和β片层的含量分别为27.7%、49.26%和占23.04%。与其三级结构最接近的是鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物。结论Ct389与tc0668基因从DNA到编码产物具有较高的相似性,ct389可能是重要的沙眼衣原体毒力基因。