溶葡球菌酶高效表达与应用

溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)是采用基因克隆技术使溶葡球菌酶基因实现外源表达所产生的蛋白质。它是Zn2+依赖的金属蛋白酶,具有肽链内切酶活性,能专一性地水解葡萄球菌细胞壁Gly五肽桥联,使金黄色葡萄球菌(特别是MRSA)细胞壁破裂,达到溶菌杀菌作用,而不产生耐药性。作为一种抗菌剂,在兽药与临床等领域具有巨大的应用潜力。综述对溶葡球菌酶的来源、作用机制、不同表达系统及前景与展望进行综述。     

β-1,4-葡聚糖内切酶egl3基因在乳酸乳球菌中分泌表达的研究

研究采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36eusp45-egl3及重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3,分析了重组乳酸乳球菌表达β-1,4-葡聚糖内切酶的效果及其降解滤纸和小麦秸秆的能力。结果表明,重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3经28h培养能胞外分泌酶活为1 016U/L的β-1,4-葡聚糖内切酶,有效地降解了羧甲基纤维素钠。在30℃恒温培养10d时,重组乳酸乳球菌L.lactis subsp.lactis MG1363/pMG36e-usp45-egl3降解滤纸和小麦秸秆为其提供发酵底物,分别产生乳酸2.55g/L和6.95g/L,pH分别降至5.10和4.84,干物质降解率分别为4.22%和29.36%。     

具脂肪酶和酯酶活性酵母菌的选育及酶学研究

从青岛市区含油土壤中筛选得到一株酵母 S9菌株 ,它可以同时产生较高酶活的脂肪酶和酯酶 .对影响 S9产脂肪酶和酯酶的各种因素进行了研究 ,1 %的可溶性淀粉为最佳碳源 ,最适的初始培养 p H和温度分别为 p H6.5和 2 8℃ ,对 S9脂肪酶和酯酶的各种酶学性质进行的研究表明 ,脂肪酶和酯酶的最适作用温度都为 3 0℃ ,最适作用 p H分别为 7.0和 8.0 ,两者都属于常温酶 ,在3 0～ 40℃范围内比较稳定 ,脂肪酶在中性偏碱的 p H环境中比较稳定 ,酯酶属于碱性酶 ,在 p H7.5～ 1 0 .5范围内相当稳定     

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。     

乳酸克鲁维酵母的发酵优势及在食品酶制剂领域中的应用

乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母,具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广、分泌蛋白能力强,不产生内毒素和对人类安全等优点。其作为宿主系统表达食品用酶也已显示出巨大的潜力。从生物学特性、菌种选择、发酵工艺优化、表达效果分析、外源蛋白修饰加工诸多方面阐述了乳酸克鲁维酵母发酵特点,并指出其具有的独特发酵优势。简述了乳酸克鲁维酵母在食品酶制剂领域中的应用。     

重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质

目的:在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥L-半胱氨酸脱巯基酶AtLCD(H2S内源产生关键酶),确定最佳诱导表达和纯化条件,并研究重组酶的酶学性质。方法:对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-LCD进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,将纯化的目的蛋白AtLCD进行酶学性质的研究。结果:重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.1 mmol/L IPTG,30℃诱导3 h。500mmol/L的咪唑洗脱Ni柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明,酶的最适pH为9.5,最适作用温度为37℃,最适条件下的以L-Cys为底物的米氏常数(Km)为1.572 mmol/L,Vmax为1.52 nmol/mg·min。金属离子Mg2+,Fe3+和EDTA对重组酶的活性有一定的抑制作用,Ba2+、Ca2+和Co2+在一定程度上提高了酶的活性,其中Co2+效果更强。蛋白变性剂SDS和酶抑制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论:明确了重组AtLCD的酶学性质和最佳诱导表达及纯化条件,为该LCD的深入研究和气体信号分子H2S在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了基础。     

乳酸片球菌素Ped-A基因表达载体的构建

乳酸片球菌素可以作为防腐剂延长食品的保鲜期,为研究和开发可食用级别的防腐剂,将乳酸片球菌素结构基因Ped-A全长和不含信号肽的序列克隆至乳酸菌表达载体p MG36e和p NZ8048,经酶切鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5α和DHB4中含有插入Ped-A基因全长和不含信号肽的序列的重组质粒。结果表明,成功构建了乳酸片球菌素Ped-A基因的乳酸菌表达载体p MG36e/Ped-A(全长/片段)、p NZ8048/Ped-A(全长/片段)。     

S-2-氯丙酸脱卤酶在毕赤酵母中的重组表达

根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。重点考察了基因拷贝数和甲醇浓度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,甲醇浓度为1%时较佳,重组脱卤酶的酶活可达236U/L。重组毕赤酵母具有很好的遗传稳定性。对该酶最适反应温度及pH进行研究,表明其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5。     

海底沉积物中几丁质酶的筛选、分离及活性分析

目的:从海底沉积物中筛选得到一株几丁质酶活性较高的菌株,分离纯化菌株分泌的几丁质酶,并对其活性进行酶学分析。方法:以中国南海北部湾的沉积物为样本,结合透明圈法及DNS法筛选菌株。采用几丁质结合能力分析及多种层析方法分离纯化菌株分泌的几丁质酶,对其中一种几丁质酶进行酶学性质分析。结果:共筛选获得21株几丁质酶产生菌,其中分泌的几丁质酶活性最高的为蜡样芽孢杆菌B04(Bacillus cereus strain B04)。发现该菌共分泌6种含有几丁质结合域的蛋白。从蜡样芽孢杆菌B04发酵液中,分离纯化得到分子量为36 k Da的几丁质酶。研究发现,该酶是蜡样芽孢杆菌B04的一种主要的几丁质酶,其最适p H为4.0,最适反应温度为60℃,在p H 3.0~10.0范围内活性稳定,Co2+对其活力有明显促进作用,Ag+有显著的抑制作用。结论:为几丁质酶的工业化应用提供了基础。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质。方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性。用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究。结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性。该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2+和Zn2+的强烈抑制。结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础。     

壁画——一个环境的表情

信息,网络时代的来临,对人类的生存环境和思想状态产生了深远而广泛的影响,后现代艺术的探索发展,使壁画艺术在环境中的关系也发生着多种的变化。80年代中国壁画有个惊人的发展．如今的壁画创作,在强调大众环保,人居健康的大环境下．壁画与环境的关系有了更密切的联系,对壁画创作提出了更高的要求。     

光幕——演绎电梯新表情

GB7588—2003第7．5．2．1．1．3条有这样的规定：当乘客在层门关闭过程中，通过入口时被门扇撞击或将被撞击，一个保护装置应自动地使门重新开启。这种保护装置也可以是轿门的保护装置。     

表皮·类型·空间--纽特林和李迪克事务所作品印象

纽特林和李迪克是当代荷兰重要的青年建筑师事务所.他们的建筑设计不仅继承了荷兰建筑一贯的理性主义和功能主义特点,还发展出自己独特的建筑语汇.本文着重分析他们的三个建筑作品,并阐述了在探索各种与众不同的建筑模式过程中,他们所采用的新颖方法和观念.     

金字塔的现代表情新Metzo学院大楼

从本世纪初起，荷兰建筑的整体水平一直高居欧洲前列，并以先锋派的姿态倡导建筑的时代精神，产生深远的国际影响，大批优秀的荷兰建筑师涌现出来。Erick Van Egeraat是荷兰很成功的Mecanoo建筑事务所的创始人之一。他曾经离开Mecanoo，创办了他自己的建筑事务所，也很成功。目前他的实践活动主要在鹿特丹，这里不仅是其事务所的总部所在地，也是他设计生涯的开始之地。Erick Van Egeraat的整体规划设计和建筑设计的创意经常在比赛中获奖，而且私人客户也很欣赏他的作品，在他的作品中，总是考虑到丰富的细节和运用全新的建筑形式。     

腈水解酶克隆表达、固定化及分子改造的研究进展

随着基因工程技术的快速发展,通过对不同菌株腈水解酶基因的分析,将其克隆到表达菌株内,可以构建高效并且稳定的基因工程菌。对腈水解酶进行分子改造可以明显提高酶的活性、稳定性、底物耐受性和底物特异性等性能,为腈水解酶的工业化应用提供了可能。综述了腈水解酶的来源、结构、催化机制、克隆表达、固定化及分子改造等方面的研究进展。同时对腈水解酶的研究进行了展望,具有重要的指导意义。     

门窗洞墙--古典园林的小品之妙

造园好似绘画,游园犹若赏画,“刹宇隐环窗,仿佛片图小李;岩峦堆劈石,参差半壁大痴”。小李是指唐代山水画家李昭道。其父李思训(653～718)“书画称一时之妙,……其画山水树石,笔格遒劲,……时人谓之大李将军。”李昭道颇能继承家学,故人称小李将军。李昭道工画金碧山     

上海当代艺术博物馆的文化表述

文章通过原上海南市发电厂改造为2010年上海世博会城市未来馆,并再次改造为上海当代艺术博物馆的六年实践历程,审视了文化取向背景下的中国当代艺术馆的现实处境与未来走向,提出了有限干预、日常性介入、弥漫性探索的建筑策略,表述了一个源自于人文理想的理念如何演变为触手可及的现实文化图景.     

结构美的建筑表达与建筑美的结构实现

人类对美的追求是与生俱来的,对建筑美的追求也不例外。以往通常认为建筑的美观与否是建筑师的事,其实结构工程师也是追求设计的美的,这就是结构美。美的建筑加上美的结构会造就真正的艺术瑰宝,因此结构师是可以和建筑师共同来创造美好的建筑的。有了这种追求,相信结构工程师的工作会更有乐趣,也会更有成效。那么什么叫做结构美?我认为应该包括三方面的内容:首先是要符合力学的逻辑、力学的原则。力学原则对结构设计有很大的指导意义,这是结构工程师必须遵守的。比如力的传递路线明确、刚度分布均匀等都     

探索石油矿区宣传思想文化体系建设思考

坚持团结稳定,鼓劲、正面宣传为主,是宣传思想工作必须遵循的重要方针。我们正在进行具有许多新的历史特点的伟大斗争,面临的挑战和困难前所未有,必须坚持巩固壮大主流思想舆论,弘扬主旋律,传播正能量,激发全社会团结奋进的强大力量。