吉林省2001～2016年成人麻疹病毒核蛋白基因特征分析

目的分析吉林省2001~2016年成人麻疹病毒核蛋白(nucleoprotein,N)的基因特征。方法选取吉林省2001~2016年26株成人麻疹病毒代表株,分离病毒、提取核酸、通过RT-PCR扩增得到麻疹病毒N蛋白基因片段,测序后,运用生物信息学软件进行序列比对分析。结果吉林省2001~2016年成人麻疹发病构成比呈逐年升高趋势;26株成人麻疹病毒株均为H1基因型H1a基因亚型,与中国疫苗株S191和H1a代表株相比,其N蛋白核苷酸和氨基酸序列同源性均呈波动下降趋势;氨基酸突变位点数量显著增多,第47、77、82、117、122、136、147位点熵值较高,可变性较大。结论吉林省2001~2016年成人麻疹病毒N蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性逐年降低,基因突变位点数量显著增加,成人麻疹发病构成比逐年攀升,需持续监测成人麻疹N蛋白变异情况,并结合血清学和流行病学制定免疫策略,控制成人麻疹发病。     

2007年吉林省散发野型麻疹病毒H基因序列分析

目的分析2007年吉林省散发野型麻疹病毒的基因型别和特征。方法对2007年吉林省分离到的3株散发麻疹野型病毒,经RT-PCR扩增血凝素(H)基因片段,克隆到pMD19-T载体,进行酶切鉴定及序列测定,并分析核苷酸序列,与GenBank中麻疹病毒的22个代表株H基因序列的同源性进行比较。结果RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为570bp的片段,克隆至pMD19-T载体后,酶切鉴定结果与预期相符。3株麻疹病毒均属H1基因型,其H基因之间同源性为98.5%～99.6%,与其他已知麻疹病毒的22个基因代表株相比,在核苷酸水平上最大变异为9.7%。3株病毒与H1a参考株Chin93-2、H1b参考株Chin94-5和H1c参考株Chin94-7的平均遗传距离分别为0.007～0.015、0.013～0.021和0.015～0.023。结论H1a基因型毒株是导致吉林省2007年春季麻疹散发的优势毒株。     

H_5N_1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及分子进化分析

目的　克隆H5N1 亚型禽流感病毒HA基因并进行分子进化分析。方法　应用RT PCR方法 ,以 2株H5N1 亚型禽流感病毒RNA为模板 ,扩增了HA全基因cDNA。将HAcDNA基因克隆于pUCm T载体 ,并对其进行了测序。结果　所克隆的HA基因全长为 1731bp ,共编码 5 6 8个氨基酸。将该毒株与其它 10株H5亚型禽流感病毒HA基因序列核苷酸及氨基酸进行比较 ,其核苷酸同源性在 80 5 %～ 99 2 %之间 ,氨基酸序列同源性在 89 4 %～98 6 %之间。高致病性毒株HA基因裂解位点存在多个碱性氨基酸插入。结论　为禽流感基因工程疫苗的研制奠定了基础 ,同时通过分子进化分析也揭示了各毒株间的亲缘关系。     

乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株全基因序列分析

目的对我国乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3株鼠脑53代(P3-Smb53)进行全基因序列测定及分析。方法提取P3-Smb53株病毒全基因组RNA,逆转录合成为cDNA,以其为模板分段进行PCR扩增,并测序;序列拼接后,利用NCBI的Blast程序和DNASTAR软件包中的MegAlign软件与GenBank中登录的5个基因型别的177株乙脑病毒全基因序列、551株乙脑病毒E蛋白序列进行比对。结果 P3-Smb53株病毒基因组全长10 976个核苷酸,与177株乙脑病毒株的全基因序列核苷酸同源性为79.6%~99.7%,氨基酸同源性为91.3%~99.7%;与GenBank中登录的551株乙脑病毒E蛋白氨基酸同源性为91.0%~99.8%,在E蛋白12个关键抗原性位点中,所有毒株均非常保守;与GenBank中登录的P3株全基因序列核苷酸同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.5%。结论乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株虽然与不同基因型毒株间的氨基酸差异较大,但在关键抗原位点上高度一致,理论上能够抵抗目前国内外所有乙脑分离株的感染。     

肠道病毒71型甘肃分离株VP1基因特征分析

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)甘肃分离株VP1基因的特征。方法应用RT-PCR法扩增4株EV71甘肃分离株(46F、47F、51F和55F)的VP1基因,克隆入pTA2载体,进行核苷酸序列测定,并进行序列的同源性比较及进化树分析。结果 4株病毒VP1核苷酸序列长度均为891bp,推导的氨基酸序列含297个氨基酸。51F与55F毒株核苷酸和氨基酸同源性均为100%,46F与47F的同源性分别为99.6%和99.0%,4株病毒与EV71的C4亚型毒株核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在99%以上。同源性和进化树分析显示,4株分离株分属2个群,其中51F和55F毒株同属一个群,其与昆明分离株kunming41-08亲缘关系最为相近;46F和47F同属一个群,其与内蒙分离株0723F/NM/CHN/07关系最为相近。结论 4株EV71甘肃分离株属于C4亚型,为中国EV71的基因分型、分子流行病学研究提供了参考。     

一株引起病毒性脑炎的埃可病毒30型分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析2009年昆明市病毒性脑炎患儿粪便中分离获得的埃可病毒30型(Echovirus30,Echo30)分离株A363/KM/2009全长VP1基因序列特征。方法从疑似病毒性脑膜炎患儿粪便样本中分离Echo30,提取病毒RNA,采用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序。采用NCBI BLAST软件对所测定的序列进行数据库比对;采用Geneious软件对Echo30分离株全长VP1基因的核苷酸及氨基酸同源性进行分析;采用Mega 5.1软件对A363/KM/2009分离株进行VP1基因分析,并与20个参考株的VP1序列进行比较。结果分离株为A363/KM/2009,其VP1基因的核苷酸长度与其他Echo30一致,均为867 bp;与其他Echo30分离株核苷酸同源性在76.9%~95.7%之间,氨基酸同源性在88.7%~99.7%之间;与中国株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为84.5%~95.7%和96.9%~99.7%,其中与中国浙江分离株Echo30/zhejiang/10/4的同源性最高,为95.7%;与广西分离株GX10/15的同源性最低,为84.5%。氨基酸序列分析显示,与其他中国株包括脑脊液分离株相比,未见特异的突变位点;与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为76.9%~86.3%和88.7%~97.3%;基因进化树分析显示,与其他中国株分属不同的两个分支,而与Echo30/zhejiang/10/4和Echo30/zhejiang/4/04(CSF)株亲缘关系较近。结论 A363/KM/2009分离株为肠道病毒Echo30,属于中国两个分支中的一支。     

肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因核苷酸序列分析

目的对肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因进行核苷酸序列分析,了解该毒种的基因稳定性。方法根据汉坦病毒标准株设计特异的PCR引物,用RT-PCR技术分段扩增疫苗株84FLi株的M和S基因片段,PCR产物纯化后直接测序,并进行遗传进化分析。结果疫苗株84FLi株M基因片段的核苷酸序列与GenBank中收录的HTN型毒株的M基因核苷酸序列的同源性为83.5%～99.9%,而与SEO型毒株的同源性为70.2%～72.0%。其S基因与HTN型毒株的同源性为85.9%～99.6%,与SEO型毒株的同源性为69.4%～70.8%。疫苗株84FLi株的M和S基因的氨基酸序列与GenBank中收录的HTN型汉坦病毒84FLi株M和S基因的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和99.5%。从遗传进化树上可以看出,疫苗株84FLi株与GenBank中收录的84FLi株位于一个独立的分支上,与其他HTN型病毒亚型分布于不同分支上,与其他HTN型病毒亚型亲缘关系较远。结论肾综合征出血热灭活疫苗毒株84FLi株M和S基因片段的核苷酸和氨基酸序列未发生较大变异,说明在传代过程中该疫苗株在基因水平上并未发生较大改变。     

流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84六代次基因序列分析

目的分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较。方法WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基因及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树。结果WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定。与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化。7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%。2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%。结论WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向。WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定。     

低神经外毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征

目的探究低神经毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征,以期找出其低毒力的分子基础。方法采用RTPCR法扩增M47株病毒全长基因片段,测定其序列,并与GenBank中19株代表性乙脑病毒株全基因序列进行核苷酸和氨基酸比对分析。结果 M47株属于基因Ⅲ型,与GenBank中19株代表性乙脑病毒株核苷酸序列同源性为79.4%~99.6%,氨基酸序列同源性为91.3%~99.6%;氨基酸序列比对发现,该毒株存在一个独特的氨基酸位点改变E-29(S-R)。结论 M47株独特的氨基酸位点改变E-29(S-R)可能是导致其低神经外毒力的原因。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

吉林省2011年手足口病死亡病例肠道病毒71型分离株全基因组基因特征分析

目的分析吉林省2011年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)死亡病例标本中分离获得的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株全基因组基因特征。方法采用分段RT-PCR法对2011年吉林省HFMD死亡病例EV71分离株JL2011-56全基因组进行扩增和测序。利用Clustal X2和MEGA5软件构建分离株JL2011-56与Gen Bank中27株参考株的全基因组序列和VP1区全基因组序列的进化树,分析Jl2011-56株的流行病学特征;同时与Gen Bank中12株C4a基因亚型参考株进行全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。结果 JL2011-56分离株属于C4a亚型,核苷酸序列和氨基酸序列与山东分离株SDLY107(JX244186.1)同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与EV71原型株Br Cr的同源性分别为79.9%和95.7%。结论 JL2011-56分离株与山东株亲缘关系较近,可能存在共同的与中枢神经毒力相关的氨基酸突变位点。     

2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组16型毒株的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的 对2019年云南省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法 使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,设计针对CVA16全VP1基因序列引物,采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序;利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果 共分离获得26株CVA16毒株,其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析,发现3株B1a和17株B1b基因亚型;其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%～100%和98.3%～100%,与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%～99.2%和97.3%～99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%～98.1%和99.3%,与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%～98.7%和98.3%～99.7%;17株B...     

浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT-PCR方法扩增了CC-1毒株的衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果 CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在90%以上。结论 成功地克隆了FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

不同代次S191株麻疹病毒HA基因的序列分析

目的　考察麻疹S191疫苗株在长期传代过程中HA基因的变化 ,以确定用于生产的最佳代次。方法　对麻疹S191疫苗株鸡胚细胞系 (CEC) 2 0、30代病毒株及S191株羊膜系病毒株 (强毒 )HAM42的血凝蛋白 (HA)基因进行RT—PCR ,克隆到PUC质粒后进行测序。结果　 2 0代和 30代疫苗的HA基因的 185 4个碱基序列中未出现核苷酸的变化 ,但二者与HAM42株相比有两个核苷酸的变化 ,分别在 15 17和 1799位 ,并导致 5 0 6位的Gly变为Asp ,6 0 0位的氨基酸由Glu变为Val。结论　麻疹病毒的减毒株与强毒株存在差异。而麻疹减毒株在鸡胚细胞的长期传代中 ,HA基因未出现明显变化 ,没有出现抗原漂移 ,30代毒株与 2 0代毒株是一致的     

一株柯萨奇病毒A9分离株的VP1基因遗传特征分析

目的分析引起病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)的一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)A9分离株(CVA9)的VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对VE患儿粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1全基因,并测序,采用Mega 6.1和Geneious 5.6.5等软件分析其序列,并构建系统进化树。结果从5份VE患儿粪便中分离到一株人CVA9,命名为A108/YN/CHN/2009,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVA9一致,均为906 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4%~98.2%和96.4%~99.3%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~96.0%和92.7%~99.0%。在进化树上与其他中国分离株属同一分支中不同两个亚分支,与JB141230009亲缘关系较近。结论 A108/YN/CHN/2009分离株为肠道病毒CVA9血清型,与其他中国分离株同属一个基因簇。     

中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。