抗菌肽基因在E.Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70 bp的DNA片段,用"片段拼凑"的方法通过三步PCR扩增得到目的基因,天蚕素基因被克隆到PUC19载体上,再转化大肠杆菌JM109.电泳分析重组质粒,确定天蚕素基因已转化到JM109上.摇床发酵转化子,IPTG诱导表达目的肽,最后提纯表达产物.SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现,荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致,最后确定天蚕素在JM109中得到表达.抑菌圈活性实验表明,表达肽具有一定抗菌活性.     

响应面法优化天蚕素抗菌肽培养条件的研究

目的:通过响应面分析方法对天蚕素抗菌肽培养条件进行优化。方法:以天蚕素抗菌肽生产菌株KJ05出发,使用Plackett-Burman和响应面分析法对天蚕素抗菌肽生产菌株KJ05进行培养条件优化,结果:从8个因素中筛选出3个显著因子:葡萄糖、起始pH和接种量,优化结果为葡萄糖含量为5.7%,接种量为5.6%,起始pH为6.4,优化后培养基所产的天蚕素抗菌肽平均杀菌效价达到12852U/mL,优化后培养基在500L发酵灌中所产的天蚕素抗菌肽杀菌效价达到15520U/mL。结论:优化后结果稳定,较优化前效价提高30.7%。     

响应面法优化天蚕素抗菌肽培养条件的研究

目的:通过响应面分析方法对天蚕素抗菌肽培养条件进行优化。方法:以天蚕素抗菌肽生产菌株KJ05出发,使用Plackett-Burman和响应面分析法对天蚕素抗菌肽生产菌株KJ05进行培养条件优化,结果:从8个因素中筛选出3个显著因子:葡萄糖、起始pH和接种量,优化结果为葡萄糖含量为5.7%,接种量为5.6%,起始pH为6.4,优化后培养基所产的天蚕素抗菌肽平均杀菌效价达到12852U/mL,优化后培养基在500L发酵灌中所产的天蚕素抗菌肽杀菌效价达到15520U/mL。结论:优化后结果稳定,较优化前效价提高30.7%。      

设计天蚕素抗菌肽在E．coli中的表达及活性鉴定

为了研究天蚕素抗菌肽的构效关系,进一步提高其抗菌活性,收集并整理了62条天蚕素,通过生物信息学比对(blast),发现其中含有大量保守序列.在此保守序列的基础上,根据天蚕素结构特征,设计了4条抗菌肽.将设计抗菌肽的基因克隆到载体PUC19上,在大肠杆菌JM109中融合表达目的多肽,并促其形成包涵体.包涵体洗涤纯化后,用溴化氰裂解除去融合蛋白质,抑菌圈法测定其抗菌活性,结果表明其中抗菌肽AMP-CecC具有较强的抑菌活性.     

天蚕素抗菌肽(Cecropin A)融合蛋白的表达及其分离纯化工艺研究

通过单因素实验确定了天蚕素抗菌肽融合蛋白表达的最佳条件,即温度为31℃,种子菌接种量为2.0％,培养基pH值为6.5,诱导时间为10 h,此时融合蛋白的表达量占细胞总蛋白的30.6％;开发融合蛋白纯化工艺,将工程菌细胞超声破碎后,所得包涵体使用8 mol/L尿素溶液溶解,泵入2 mol/L尿素溶液中搅拌使蛋白质复性,复...     

4种鳕鱼多重PCR检测方法建立

为了建立可对鳕鱼DNA进行特异性检测的PCR方法,从Gen Bank数据库下载太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、绿青鳕4种鳕鱼的突触素样蛋白(pantophysin Pan I)基因序列,并用Bioedit 7.0软件对上述不同鳕鱼的该基因碱基序列进行比较。根据引物设计的基本原则,选择了鳕鱼与其他鱼类碱基序列上差异位点较多片段,设计出太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、绿青鳕PCR特异性引物。用该引物分别对从7种鳕鱼和14种非鳕鱼鱼类的肌肉、脏器组织中提取的DNA进行PCR扩增。实验将所设计的引物通过两种引物组合、三种引物组合以及四种引物组合,进行多重PCR试验,结果表明,大西洋鳕、绿青鳕、太平洋鳕和狭鳕四种鳕鱼分别出现597、392、266、527 bp大小的清晰条带,4种引物之间相互不干扰,具有显著特异性。该方法具有较高灵敏度,低至4 ng/μL混合样品仍可检出。     

基于弧菌毒力基因多重PCR法的建立及其在副溶血弧菌毒力基因检测中的应用

针对副溶血弧菌常见的11种毒力基因(tox R、Collagenase、tox S、trh、tdh、tlh、Ure R、Fla A、omp W、Asp A、fur),建立了两套六重PCR检测体系,应用于副溶血弧菌环境分离株和水产品分离株的毒力基因分布情况调查。在调查的248株副溶血弧菌中,鞭毛丝蛋白基因Fla A、外膜蛋白基因omp W和铁吸收调节蛋白基因fur的分布最广(100%),其次为碱性丝氨酸蛋白酶基因Asp A(99.60%),胶原蛋白酶基因Collagenase、不耐热性溶血毒素基因tlh以及毒力调控基因tox R和tox S的分布率均在90%以上且tox R和tox S的分布极为相似,尿素酶基因Ure R的分布极少(1.21%),而耐热直接溶血素基因tdh和耐热相关溶血素基因trh在这248株副溶血弧菌中没有检出。本研究建立的多重PCR检测体系能快速、高效地检测多个毒力基因的分布情况,为副溶血弧菌的毒力机制研究和风险评估提供方法和依据。     

多重PCR技术在病原微生物检测中的应用

多重PCR技术特异性强、灵敏度高,被广泛应用于生命科学研究的各个领域。本文阐述了多重PCR技术原理,并就其近年来在人类、动物疾病、农作物病害、食源性致病微生物等方面的研究进行了介绍,提出了该技术目前存在的问题,并对其前景进行了展望,旨在为多重PCR技术更好的应用提供参考。     

淀粉酶基因的克隆及其在工业啤酒酵母中的表达

以扣囊复膜孢酵母菌总DNA为模板，通过PCR扩增克隆到约1．5kb的α-淀粉酶基因(AMY)。用酵母菌穿梭载体YEp352为出发质粒，磷酸甘油酸激酶基因1(PGK1)启动子和乙醇脱氢酶基因1(ADH1)终止子为调控元件构建了含α-淀粉酶基因编码序列的酵母菌重组表达质粒pLA8。pLA8导入工业啤酒酵母菌，在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子，转化子培养液中α-淀粉酶活性为1．1U／ml，细胞破碎液的酶活性为0．3U／ml，而受体菌培养液及细胞破碎液中末检测到α-淀粉酶活性。     

多重PCR技术在食源性病原细菌检测中的应用

食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一,快速检测食品中病原细菌是及时有效预防病原细菌传播及食物中毒的重要前提。多重PCR作为一种可同时检测多种病原细菌的方法应用日益广泛。本文介绍了多重PCR技术在食源性病原细菌检测中的应用现状及其多重PCR反应条件的优化,同时提出了存在的问题并对应用前景作了展望。     

肺炎克雷伯氏杆菌二羟丙酮激酶基因(dhaKL)克隆与表达

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组为模板,通过PCR技术成功地扩增了dhaKL基因,并构建了pET-28a(+)/dhaKL表达载体。DNA序列分析的结果表明:dhaKL基因由2个开放阅读框架组成:ORF1全长为1017bp,编码356个氨基酸;ORF2全长633bp,编码210个氨基酸。SDS-PAGE电泳结果表明:dhaKL基因获得了有效表达,上清液中的酶活性为15.6U/mL。     

甘油脱水酶结构基因(gldABC)克隆及序列分析

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(gldABC)并将该基因克隆到pMD19-TSimple载体。通过对该基因的序列分析,甘油脱水酶(gldABC)结构基因的全长为2816bp,由三个独立的开放阅读框架组成,三个独立的读码框分别由1668、585、426bp组成,分别编码556、195、142个氨基酸。通过BLAST同源性分析,该基因与GenBank中已发表的gldABC基因(U60992)的核苷酸序列同源性为99.39%。氨基酸的同源性为100%。     

dhaT基因克隆及其与gldABC基因串联表达载体的构建

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(dhaT)并将该基因克隆至pMD19-T Simple载体。基因的序列分析表明,dhaT基因全长为1164bp,编码387个氨基酸。将含有自身核糖体结合位点的dhaT基因片段插入到pMD19-T Simple/gldABC质粒的gldABC基因下游,形成重组克隆质粒pMD19-T Simple/gldABC-dhaT,并进一步将gldABC与dhaT串联基因亚克隆到表达载体pET28a(+)上。     

蜂毒肽与死亡素杂合肽(MT)在大肠杆菌中融合表达的研究

人工合成的蜂毒肽与死亡素的杂舍肽DNA序列，经聚合酶链式反应（PCR）扩增后得到带有BamHI和XhoI限制性酶切位点的序列．将此基因克隆至载体pET-32a，成功构建了重组质粒pET32a—MT．测序验证后转化大肠杆菌BL21（DE3），37℃IPTG诱导，获得高效表达，融合蛋白经Ni柱亲和纯化后用肠激酶切下杂合肽，杯碟法检验酶切产物具有抑菌活性。     

Primers for Amplifying an Alanine Racemase Gene Fragment to Detect E. coli Strains in Foods

Specific oligonucleotide primers for detecting Escherichia coli in various foods were designed based upon the conserved sequences of the E. coli air gene from positions 322 to 345 and from 664 to 687. Bacteria and food samples were treated at 100°C for 10 min in 1% Tween 20 containing 5% NaCl and 1 mM EDTA, then used as templates for polymerase chain reaction (PCR). The oligonucleotide primers were specific to E. coli, except for Shigella species, when tested with 67 strains of E. coli, including such serotypes as O157:H7 and O111, and 32 strains of non-E. coli species. The oligonucleotide primers could prove useful for detecting E. coli in beef, chicken, pork, tomato, soybean, potato, cow's milk, and egg.     

北京棒杆菌高丝氨酸脱氢酶基因的克隆与表达产物活性测定

以北京棒杆菌E31染色体DNA为模板,用PCR法扩增了高丝氨酸脱氢酶(HD)基因。将结构基因装载于pET-28a质粒的T7启动子下游,得到了重组表达质粒pET-HD。将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明,高丝氨酸脱氢酶的活性为不含重组质粒的对照菌的10倍。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。     

具纤溶活性菌株ND2的筛选及其纳豆激酶基因的克隆、表达

从市售的纳豆制品中分离并纯化出一株具有高效纤溶活性的菌株ND2,经生理生化特性及16SrRNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。通过正交试验优化菌株ND2的发酵条件,得到ND2产纳豆激酶的最佳条件:氮源-大豆蛋白胨,碳源-淀粉,碳氮比3:1,37℃,pH6.0。经PCR扩增得到825bp的纳豆激酶成熟肽基因,采用pET32a(+)表达载体和BL21(DE3)为宿主菌,在温度为37℃、1‰IPTG浓度下可诱导获得较高表达量的重组纳豆激酶。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

将来自嗜热脂肪芽孢杆菌IAM 110 0 1的高温乳糖酶基因bgaB亚克隆到具强启动子的大肠杆菌载体 pKK 2 2 3 3中 ,经IPTG诱导后 ,表达出的重组蛋白质仍具有耐高温活性 ,其相对分子质量与天然蛋白质相似 ,表达量为 1.5U/mg ,比出发菌株高 10倍     

抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的载体蛋白

抗菌肽是天然免疫系统的主要成分,能有效抵御病原微生物的侵害。目前其作为新型药物受到人们很大的关注,由于从天然资源中分离或化学合成成本较高,因此应用基因重组技术生产抗菌肽很迫切。本文主要讨论了抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达、融合表达中常用的载体蛋白及新的融合载体SUMO（小泛素修饰因子）的主要性能。