幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究

目的 通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础。方法 用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中。结果 经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性。结论 融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础。     

Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒菌重组疫苗的制备和生物效应研究

目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗,并观察其生物学效应。方法以幽门螺杆菌标准株——悉尼株(SS1)的基因组DNA为模板,构建Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB。经口服免疫BALB/c小鼠后,检测肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体,同时观察小鼠体重、胃黏膜炎症程度等一般情况。结果构建Hp-UreB的SL3261/pTC01-UreB菌株,连续传80代可稳定表达Hp-UreB,菌落提取质粒后酶切及PCR鉴定均与pTC01-UreB符合;SDS-PAGE和Western blot显示pTC01-UreB转化SL3261可表达与Hp-UreB亚单位相符的相对分子质量约61000蛋白,该蛋白能与抗Hp兔血清反应;SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠的肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体明显增高,而小鼠体重和胃粘膜炎症指数与对照组差异无显著意义。结论Hp-UreB的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB口服免疫小鼠可诱导特异性免疫应答。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

B族链球菌表面免疫原性蛋白的免疫原性及其抗体保护功能

目的制备B族链球菌(GBS)表面免疫原性蛋白(Sip),研究其免疫原性及抗体保护功能,为GBS蛋白疫苗研究奠定基础。方法采用基因重组技术构建表达载体,并表达GP-Sip融合蛋白。用pET-Sip融合蛋白免疫小鼠,并免疫家兔制备多克隆抗体。Western blot检测GP-Sip蛋白特异性,ELISA检测家兔及小鼠血清中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的功能。结果表达载体经酶切和测序证明构建正确,GP-Sip蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,纯化后纯度可达90%以上。Western blot显示GP-Sip蛋白可与pET-Sip蛋白的免疫血清发生免疫反应。ELISA显示Sip可诱发小鼠产生高水平的IgG抗体。Sip抗血清具有明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用。结论已成功构建GP-Sip表达载体,并高效表达了Sip。该蛋白具有良好的免疫原性,其抗体具有良好保护功能,可作为GBS蛋白疫苗成分或荚膜多糖疫苗载体成分。     

幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的保护性研究

目的探讨幽门螺杆菌融合蛋白HCTV(HpaA-CtxB-VacA,HCTV)小鼠口服后的免疫应答。方法以Ni2+-NTA柱纯化HCTV为抗原,与重组蛋白HpaA和VacA分别给小鼠灌胃免疫,ELISPOT检测小鼠胃黏膜和派伊尔小结(Peyer patches,PP)特异性抗体分泌细胞(Antibody-secreting cells,ASC),ELISA检测血清IgG和IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA。结果ELISPOT和ELISA检测结果表明,胃黏膜和PPsIgA-ASC、IgG-ASC数量明显增加,尤以sIgA-ASC为甚,同时血清IgA和IgG、粪便sIgA、肠黏液sIgA也明显高于HpaA组、VacA组和对照组,差异均有显著意义。结论已成功获得纯化的融合蛋白HCTV,小鼠灌胃免疫可有效诱导黏膜免疫应答,产生高水平的sIgA,可作候选Hp口服疫苗。     

幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出206bp和336bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致。重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Westernblot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论HpUreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。     

幽门螺杆菌HpaA重组蛋白的表达及免疫效果检测

目的表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白,并检测其抗原性和免疫原性。方法用PCR方法从H.pylori DNA中扩增hpaA基因片段,插入原核表达载体pQE-30,转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Ni2+-NTA树脂纯化后,用Westernblot鉴定其反应原性。用重组蛋白免疫家兔,检测其免疫原性。用重组蛋白免疫小鼠,分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量。结果重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确,所得序列完整,插入的基因片段全长783bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.3%。表达产物相对分子质量为30000,目的蛋白表达量占全菌总量的31.67%,主要存在于碎菌后上清中,纯度在90%以上。Westernblot显示该蛋白可与病人血清特异性结合,免疫血清能与重组蛋白反应,双扩散效价为1:16。小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组。结论已获得高纯度的HpaA重组蛋白,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制幽门螺杆菌疫苗。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因的克隆及其高效表达

目的克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因,构建原核表达载体,并进行高效表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UreB基因,双酶切后,与质粒pET-22b(+)连接,构建表达载体pET-22b(+)/UreB,分别转化E.coliBL21(DE3)、Origam(iDE3)和Rossetta(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经酶切及测序,证明幽门螺杆菌UreB基因的原核表达载体构建正确。3种重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,均可见相对分子质量为64000的目的蛋白条带,Rossetta(DE3)重组菌目的蛋白表达量最高,约占菌体蛋白的35%。Western blot结果表明,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了幽门螺杆菌UreB基因,并在大肠杆菌Rossetta(DE3)中获得了高效表达。     

幽门螺杆菌HpaA蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备幽门螺杆菌(H.pylori)HpaA蛋白单克隆抗体,并检测其对H.pylori黏附胃腺癌细胞AGS的抑制作用。方法应用PCR法扩增HpaA基因,构建重组表达质粒pQE30-HpaA,表达并纯化重组HpaA蛋白;以其为抗原免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,采用间接ELISA和Western blot法检测单抗的特异性,间接ELISA检测细胞株培养上清和腹水抗体效价,并对其进行亚型鉴定和杂交瘤细胞株稳定性分析;扫描电镜观察重组HpaA蛋白单抗对H.pylori黏附AGS细胞的抑制作用。结果重组表达质粒pQE30-HpaA经双酶切、PCR及测序证明构建正确;表达的重组HpaA蛋白相对分子质量约为30 000,可溶性蛋白含量约占65%,纯化后纯度达85%以上;经细胞融合及筛选克隆获得了2株能稳定分泌抗HpaA单抗的杂交瘤细胞株,2株单抗与其他肠道细菌均无交叉反应,能与H.pylori全菌体发生特异性反应;乳胶凝集试验证明,该单抗属IgG3、κ型;2株单抗细胞培养液的抗体效价分别为1∶128～1∶256和1∶64～1∶128,腹水抗体效价分别可达1∶6 400～1∶12 800和1∶1 600～1∶3 200;杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体;单抗可抑制H.pylori对AGS细胞的黏附作用。结论已成功制备了H.pylori HpaA蛋白单克隆抗体,为建立新的H.pylori现症感染诊疗方法奠定了基础。     

幽门螺杆菌VacA-HpaA融合蛋白的表达及其免疫学特性

目的构建H.pylori细胞空泡毒素VacA与黏附素HpaA融合基因的原核表达载体,诱导其表达融合蛋白,并检测表达产物的抗原性与免疫原性。方法用PCR从pQE30-VacA质粒扩增出VacA基因,克隆至pTrc99A-HpaA载体中,与HpaA基因融合后,插入原核表达载体pQE30中,再将pQE30-VacA-HpaA转化入大肠杆菌DH5α,诱导表达并提纯融合蛋白,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,Bradford法检测融合蛋白含量,Western blot鉴定特异性。将融合蛋白免疫家兔,得到多克隆抗血清,用双向免疫扩散和ELISA检测免疫原性。结果SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量约为65000,表达量在35%以上,主要以包涵体形式表达,蛋白含量为0·72mg/ml,具有良好的VacA和HpaA抗原性与免疫原性。结论VacA-HpaA融合蛋白已成功表达,且具有良好的免疫原性,为进一步研究制备H.pylori疫苗创造了条件。     

采用卡介苗结核蜡酸合酶启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒

目的采用卡介苗(BCG)结核蜡酸合酶(Mycocerosic acid synthase,Mas)启动子,将分枝杆菌穿梭质粒pJEM11改建为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 PCR扩增BCG基因组中Mas启动子,定向克隆至质粒pJEM11的ApaⅠ与SnaBⅠ位点之间,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas。将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)UreB基因克隆至pJMas质粒,转化耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis)mc2155,SDS-PAGE检测重组UreB蛋白在M.smegmatis mc2155中的表达,Western blot分析其反应原性。结果克隆的Mas启动子序列与结核杆菌H37Rv株的Mas启动子序列(gi31619628)同源性达99%;重组穿梭表达质粒pJMas经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;UreB基因在M.smegmatis mc2155中成功表达,表达的蛋白可与Hp阳性病人血清发生特异性反应。结论成功构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas,为构建以耻垢分枝杆菌为载体的多价疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达

目的　构建幽门螺杆菌粘附素 (hpaA)和霍乱毒素B亚单位 (ctxB)融合基因的原核表达载体 ,诱导表达并进行纯化。方法　用PCR扩增hpaA和ctxB两个目的基因片段 ,克隆至同一pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pQE hct,转化E .coliDH5α ,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT ;经Westernblot分析其免疫原性 ,采用镍离子柱进行纯化。结果　经测序HCT融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子质量约为 4 0 0 0 0。可溶性蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组融合蛋白。经Westernblot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论　已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达 ,为研制Hp口服疫苗提供依据     

以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建

目的构建以乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus coreprotein,HBc)颗粒为载体的含流感病毒M2基质蛋白胞外功能区(M2 ectodomain,M2e)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)保守表位的流感通用疫苗,评价其抗不同亚型流感病毒感染的保护作用。方法采用基因工程方法将流感病毒M2e的3拷贝重复片段与NP的CTL表位串联,插入HBc刺突顶端的免疫优势决定区,构建重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG16℃低温诱导表达。表达的融合蛋白HBc-3M2e-NP经纯化后,电镜观察病毒样颗粒形成情况。纯化的融合蛋白分别经鼻腔和腹腔免疫小鼠,对照组注射等体积的PBS,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平;以流感病毒攻毒,检测融合蛋白的保护效果。结果重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,以包涵体和可溶性两种形式表达,且可与鼠抗M2e单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度大于90%,且能够自动装配成病毒样颗粒。用该病毒样颗粒免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对不同流感病毒毒株的特异性抗体;2种途径免疫的小鼠脾组织中CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例均较对照组明显升高;攻毒试验结果显示,具有交叉保护作用。结论构建的流感通用疫苗能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答及有效的交叉保护作用,为流感通用疫苗的深入研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS3基因疫苗质粒的构建、表达及其体液免疫应答

目的构建基于Ii分子的丙型肝炎病毒(HCV)内源性靶向基因疫苗质粒,并检测其在真核细胞中的表达及免疫小鼠诱导的体液免疫应答。方法通过3轮PCR,以HCV-NS3的Th1表位(1248～1261aa)取代Ii链CLIP片段编码基因,构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,转染COS-7细胞,RT-PCR法检测其在mRNA水平的表达;用内源性靶向基因疫苗pHCV-NS3-Th1和非靶向基因疫苗pHCV-NS3经股四头肌肌肉免疫BALB/c小鼠,以生理盐水、pCI-neo和pCI-neo-Ii作为对照,检测小鼠的体液免疫应答水平。结果转染细胞中,内源性靶向基因疫苗质粒在mRNA水平获得表达;对BALB/c小鼠的免疫结果显示,只有pHCV-NS3组小鼠可以检测到针对HCV-NS3的特异性抗体,抗体滴度可达1:1024。结论已成功构建了基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,其能够在真核细胞中表达,但不能刺激小鼠产生HCV-NS3特异性抗体。     

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。