D-阿洛酮糖合成及偶联酿酒酵母发酵的研究

该研究利用含有组成型启动子的质粒pET-20b载体,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中对3种D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行异源表达,其后以D-果糖为底物进行静息细胞转化。结果表明,重组菌在摇床30 ℃、200 r/min转速下发酵48 h,能够利用D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖,转化率分别达到27.56%、23.99%和25.98%。为降低D-果糖对D-阿洛酮糖纯化过程中的影响,在产糖的过程后偶联酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）好氧发酵过程,消耗掉混合糖液中的D-果糖,结果显示转化24 h后D-果糖去除率达到94.22%,该研究为下游D-阿洛酮糖的分离和纯化提供了新的思路。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

D-阿洛酮糖的生理功能及应用研究进展

D-阿洛酮糖,作为D-果糖的C-3差向异构体,是一种新型低热量甜味剂。目前多项研究已证明D-阿洛酮糖的食用安全性,且其已被美国食品和药物管理局批准用于食品行业。D-阿洛酮糖不仅能够作为低热量甜味剂用于饮料和膳食补充品中,还因其具有预防肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化等生理功能,在健康、医疗等方面有着巨大的应用价值和潜力。该文就D-阿洛酮糖的理化性质、合成方法和其降血糖、减脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、神经保护等生理功能以及在食品和医疗领域的应用进行综述。     

Clostridium scindens ATCC35704中的D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达、纯化及活性研究

D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并成功导入E.coli BL21(DE3)中,构建了基因重组菌,诱导目的重组基因过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约31 ku处出现显著的特征蛋白条带;通过对其活性检测表明,该重组酶分别以D-塔格糖和D-果糖为底物,可以生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖,转化率分别为8.6%和27.9%。     

功能性甜味剂D-阿洛酮糖研究进展

高糖摄入引起的糖尿病、高血压等疾病严重危害着人类的生命健康,这一形势也促使人们对天然、低热量糖替代品的开发日益关注.作为一种近年发现的具有特殊生理功效的稀少糖,D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性,被称为食品中蔗糖"理想替代品".D-阿洛酮糖可以在D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化作用下进行生物合成,已被FDA批准...     

制备高含量低聚果糖联产D-阿洛酮糖的工艺研究

制备蔗糖源高含量低聚果糖主要利用色谱分离技术除去普通级低聚果糖产品中的葡萄糖和蔗糖，得到高含量低聚果糖组分和副产物组分。为进一步高值化利用副产物，赋予其功能性及扩大应用范围，在制备低聚果糖工艺技术基础上利用蔗糖转化酶、葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶、色谱分离依次处理副产物，并通过单因素试验优化D-阿洛酮糖3-差向异构酶异构反应及色谱分离纯化参数。结果得到：在反应温度45℃、p H5.75、每克底物55 U酶量、反应时间12 h的条件下，底物中果糖质量浓度在90%以上；色谱分离关键参数：洗脱液流量15 L/min，外加压力50 kPa。D-阿洛酮糖最高转化率为27.1%，成品糖浆中D-阿洛酮糖含量>91%，整体工艺总产率为91%。研究结果表明联产工艺技术可行性高，要进行工业化生产还需进一步优化。     

D-阿洛酮糖及其合成研究进展

D-阿洛酮糖是一种具有保健功能的己酮糖,可以预防糖尿病、维持正常血脂水平,避免传统甜味剂对人体造成的代谢负担,具有重要的应用价值,但在自然界中含量稀少,近年来涌现多种D-阿洛酮糖的合成方法。文章围绕D-阿洛酮糖的功能、化学合成法和生物酶异构化法等内容开展综述,重点阐述了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的来源及性质、结构及催化机制、分子改造、多酶偶联、食品级表达等方面的研究进展,旨在推进生物转化制备D-阿洛酮糖的工业发展,为保障公众营养健康提供新思路。     

海藻酸钠固定细胞产D-阿洛酮糖的研究

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用海藻酸钠作为载体,包埋重组大肠杆菌催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。以固定化细胞的酶活活力回收率为指标,优化出最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度3%,细胞包埋量60g/L,Ca Cl2浓度2%,固定化时间4h,0.01%浓度戊二醛溶液中交联4h。该条件下所得固定化细胞的酶活回收率高达76%,且具有较好的操作稳定性,重复操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE细胞的最适酶反应温度提高了5℃、最适pH与游离细胞基本一致,耐热性明显提高,p H稳定性与游离细胞一致。     

利用重组大肠杆菌和马克斯克鲁维酵母高效催化合成D-阿洛酮糖

提出了一种高效、低成本的两阶段生产D-阿洛酮糖的生产工艺。第一阶段,构建异源表达Flavonifractor plautii D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组大肠杆菌用于转化果糖,实现D-阿洛酮糖的全细胞生物合成。重组大肠杆菌在pH 7.5、65℃条件下反应最优,且在不添加金属离子、60℃反应条件下半衰期达到2.7 h,具有高热稳定性。在添加干重2.4 g/L重组大肠杆菌的D-果糖纯水溶液中,产物D-阿洛酮糖的终质量浓度为231 g/L,转化率达到33%。在添加硼酸根离子的条件下,D-阿洛酮糖的终质量浓度为378 g/L,转化率可以达到63%。在第二阶段,利用马克斯克鲁维酵母消耗混合体系中的D-果糖生产乙醇,降低分离成本。在不添加任何营养物质的情况下,在2种不同体系内,D-果糖均可以完全被消耗并产出约0.4 g/g的乙醇。该文研究结果为D-阿洛酮糖的低成本工业化生产奠定了良好的基础。     

L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose-3-epimerase,DPE）可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶（L-rhamnulose kinase,RhaB）具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,PPK）,可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta（DE3）中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35 ℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下：pH 8.5,温度35 ℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比（质量比）1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。     

D-核糖发酵液电渗析脱盐及工艺优化

D--核糖发酵液中残存着大量的无机离子,如不去除会影响后续D--核糖的纯化。目前工业上常采用离子交换树脂脱盐,随着料液含盐量的增加,其脱盐成本也成比例增加,并产生大量的废水,既不经济也不环保。为明确电渗析脱盐是否可行、具体脱盐成本及最佳的脱盐工艺,以D-D-核糖发酵液的滤液为原料,采用均相阳离子交换膜CMX和阴离子交换膜AMX组成的小试设备LANRAN-40-2040,进行了电渗析法脱盐研究。结果表明,将脱盐率控制在54%,产品收率达到97.68%,但当进一步提高脱盐率时,会有一定量的D--核糖渗透到电渗析浓缩室中,且随着运行时间的增加,浓缩室的D--核糖质量浓度增加较快。采用电渗析联合离子交换树脂脱盐工艺比全树脂脱盐工艺产品收率提高了1.9%,节约一半的离子交换树脂及酸碱用量,并减少一半的废水排放,因此为D--核糖的工业生产提供较好的参考。     

Effect of aeration and dilution rate on nisin Z production during continuous fermentation with free and immobilized Lactococcus lactis UL719 in supplemented whey permeate

The influence of dilution rate (D) and aeration on soluble and cell-bound nisin Z production was investigated during continuous free (FC) and immobilized cell (IC) cultures with Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis UL719 in supplemented whey permeate. Maximum total bacteriocin titres during non-aerated continuous FC and IC cultures were obtained for low D, with 1490 and 1090 IU mL⁻¹ for 0.15 h⁻¹ or 0.25 and 0.5 h⁻¹, respectively. For both systems, aeration increased nisin total production with maximum titres of 2560 and 2430 IU mL⁻¹ for low D, respectively, as well as specific production. Volumetric productivity was the highest for an intermediate D of 0.4 h⁻¹ during FC cultures (460 IU mL⁻¹ h⁻¹ for both aerated and non-aerated cultures), while it increased continuously with D during IC cultures, reaching high values of 1090 and 1760 IU mL⁻¹ h⁻¹ at 2.0 h⁻¹ without and with aeration, respectively. In comparison with previous data for FC batch cultures, data from this study may indicate that during continuous fermentations at steady state, some steps in nisin biosynthesis are limiting. In these conditions, nisin production by immobilized cells is reduced.     

保加利亚乳杆菌ND02发酵乳清过程中的代谢特性

利用L. bulgaricus ND02对乳清进行发酵,研究其在发酵乳清过程中的代谢特性。通过分析乳清发酵过程中代谢物的动态变化规律,评估代谢产物对发酵乳清生理功效的影响。采用液质联用技术检测L. bulgaricus ND02发酵乳清过程中代谢物质,并采用多变量统计方法对差异代谢物进行筛选与分析。通过数据库比对鉴定得到异亮氨酸、多肽、甲基-D-吡喃半乳糖苷、油酸、琥珀酸、黄嘌呤和胞嘧啶腺苷酸等37个显著差异代谢物（P<0.05）。其中,半胱氨酸、Tyr-Trp、苯乳酸和胞嘧啶核苷酸等23个代谢物在发酵乳清中的相对含量显著增加（P<0.05）。 L. bulgaricus ND02在发酵乳清过程中产生了大量的氨基酸、寡肽、有机酸和核苷酸,这些物质赋予发酵乳清特殊的生理功效和营养价值。     

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酰胺

L-谷氨酰胺（L-glutamine,L-Gln）是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产L-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性能欠缺等问题严重限制了其工业化应用。为解决这一问题,作者以实验室前期构建的L-Gln生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体L-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、过表达溶氧相关蛋白VHb提高细胞携氧能力、增强关键酶谷氨酰胺合成酶催化活性及发酵工艺优化等策略提高了L-Gln产量。最终的基因工程菌CGQ08/pDXW10-glnA<>supSc-gdh^Cg在5 L发酵罐上补料分批发酵66 h,L-Gln的产量最高达（94.5±1.8） g/L,糖酸转化率为34.8%,生产强度为1.43 g/（L·h）。本研究为L-Gln及其相关化合物的工业化生产提供了借鉴。     

Viscosity of solutions of dextrans with selected sweeteners

Effect of D-fructose, D-glucose, sucrose, maltose, and aspartame upon the viscosity of aqueous solutions of dextrans of M_w=19,500, 71,400, and 282,000 were studied. Molecular weight of polysaccharides is a dominating factor controlling the rheology of the blends. The viscosity of the dextran-sweetener blends practically linearly increased against the molecular weight of dextrans. Structure of admixed sweetener was also a factor important for the rheology of such blends. Saccharide sweeteners, e.g., all those studied in this paper but aspartame, interacted with dextrans without involvement of their 1-OH - anomeric carbon atom - pyranose ring oxygen atom moiety as indicated by polarimetric studies.     

蜂王浆中活性因子对衰老小鼠的保护作用

为了探索蜂王浆及其主要的蛋白质类、脂类功能活性因子对D-半乳糖（D-gal）致衰老小鼠的保护作用。实验通过透析、超滤、有机相萃取的方法分别提取分离了蜂王浆中粗蛋白、蛋白质类功能因子及脂类功能因子。通过连续7周每日腹腔注射100 mg/kg（以干质量计） 的D-gal建立衰老小鼠模型,并分别给予蜂王浆及不同剂量的粗蛋白组分、蛋白质类或脂类功能因子干预后,发现蜂王浆可以显著提高小鼠在T-迷宫中的准确率,并且降低肝脏器官指数,证实蜂王浆可能提高衰老小鼠的认知记忆水平,改善小鼠的衰老症状;脂类功能因子及高剂量的蛋白质类功能因子能够显著提高 T-迷宫准确率、缓解肝脏肿大。因此推测,蜂王浆中的蛋白质类功能因子和脂类功能因子都具有良好的抗衰老作用,其机制可能与提高大脑的记忆能力有关。     

Characterizing asymptotic D-values for Salmonella spp. subjected to different heating rates in sous-vide cooked beef

Inactivation rates of a cocktail of Salmonella spp. in sous vide cooked beef exposed to varied ‘come-up’ heating times of zero (control), and 1–3 h from 10 °C to the processing temperature of 58 °C were examined. The observed survival curves, determined for 58 °C, displayed a slight ‘shoulder’ followed by a non-zero asymptotic D-values. Comparisons of the survival curves confirm that the rate of heating can substantially influence the heat resistance of Salmonella spp. While there was no significant difference between the estimated asymptotic D-values for the control and 1-h come-up heating time survival curves, the estimated D-values were significantly larger for the 2- and 3-h come-up heating times curves. The estimated averages of the asymptotic D-values for the control and 1-h come-up time survival curves are approximately 5.7 min; for the 2-h come-up time curves, 7 min; and for the 3-h come-up time curves, 8 min. These findings could have substantial practical importance to food processors in sous vide cooked beef that are processed by slow heating rate/long come-up times and low heating temperatures.     

改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量

乙酰羟酸合成酶（acetohydroxy acid synthase,AHAS,编码基因ilvBN）是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3（Corynebacterium glutamicum XL-3）为底盘细胞,通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性,从而提高L--亮氨酸产量。首先利用AHAS的氨基酸序列进行同源建模,根据蛋白质结构进行丙氨酸扫描,找到突变的潜在位点,通过测定突变体酶活力和重组菌株的L--亮氨酸产量寻找最适突变体。测定结果发现将157位Gln突变成Arg能够有效提高AHAS催化丙酮酸的能力,最终重组菌株的L--亮氨酸产量达到（23.5±1.8）g/L,比出发菌株谷氨酸棒杆菌XL-3增加了51%,同时副产物L--异亮氨酸产量有所下降。因此,通过对AHAS的理性改造促进了L--亮氨酸的合成,该研究结果对后续利用蛋白质工程强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。     

白酒酿造过程中Lactobacillus panis乳酸合成关键环境因子的鉴定

Lactobacillus panis是酱香型白酒酿造过程中主要产乳酸微生物。然而,不同环境因子对L.panis乳酸合成及乳酸合成途径关键基因的表达尚未有相关研究。作者分析了温度、乳酸、乙醇及葡萄糖4种不同的发酵过程相关的典型环境因子对L.panis乳酸产量的影响。结果表明,不同环境条件能够显著调节L.panis的生长和乳酸产量,且乳酸和乙醇是酿造过程中其乳酸合成的关键影响因素。当添加10.0 g/L乳酸后,L.panis的乳酸产量最高,达到12.3 g/L;当添加体积分数4.0%乙醇后,L.panis的乳酸产量最低,仅为7.2 g/L。使用实时荧光定量PCR方法对不同条件下L.panis乳酸合成相关基因的表达进行分析,结果表明添加乳酸能够显著上调包括编码L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶的ldhL和ldhD在内的乳酸合成基因的表达。然而,添加乙醇会导致L.panis乳酸合成相关基因的整体显著下调。分析调控乳酸合成的关键环境因素,对于白酒酿造过程中乳酸和酿造微生物群落调控及白酒质量控制具有重要意义。