烟草突变体筛选与鉴定方法篇:1.烟草突变体的筛选与鉴定

烟草基因组计划重大专项2011年研究项目"烟草突变体库创制、筛选与分析"实施1年后,通过化学和生物方法创制并收获了15万份烟草突变二代种子;建立了2个序列筛选方法和10个表型筛选方法并进行了初步筛选。2012年始,该项目将全面开展烟草各种突变体的大量筛选及鉴定工作。     

烟草基因组计划重大专项成功创制了全球最大的烟草突变体库

<正>烟草基因组计划重大专项2011年度研究项目"烟草突变体库创制、筛选与分析"取得了重大突破。该项目由中国烟草总公司青州烟草研究所牵头,在国家烟草专卖局科技司和重大专项首席科学家的领导下,集合中国农业科学院生物技术研究所、西南大学、中国科学院植物研究所、中国农     

烟草青枯病抗性突变体486-K和117-K的遗传分析

烟草青枯病是一种典型的维管束细菌性病害,严重影响我国烟叶生产。为了解烟草青枯病抗性突变体的遗传规律和开发抗性相关分子标记,本研究选用EMS诱变烤烟品种翠碧一号获得的烟草青枯病抗性突变体486-K和117-K为研究对象,以翠碧一号和2个突变体为亲本,构建了两个不同的杂交组合,采用卡方检验和植物数量性状"主基因+多基因"混合遗传模型分析方法,进行群体遗传效应分析。结果表明,卡方检验显示突变体486-K和117-K的F2代各病级株数呈正态分布,存在一定性状分离。"主基因+多基因"混合模型分析发现突变体117-K的最优抗性遗传模型为2MG-A,即2对主基因为加性效应控制遗传,无显性效应和上位性效应,主基因的遗传效率为78.57%;突变体486-K的最优抗性遗传模型为2MG-ADI,即2对加性-显性-上位性主基因模型,上位性效应中以显性×显性互作和显性×加性互作效应较大,主基因遗传效率为88.34%。表明烟草青枯病抗性突变体的遗传方式以主基因效应为主,受环境影响较小。     

烟草突变体库及其在功能基因组研究中的应用

烟草突变体是烟草功能基因组学研究的重要材料。本文综述了烟草突变体在功能基因研究中的作用,构建烟草突变体库的必要性以及烟草突变体库的构建方法,并展望了烟草突变体库在烟草功能基因组学中的应用。     

烟草突变体筛选与鉴定方法篇:2.烟草抗主要病虫害突变体的筛选与鉴定

参照烟草品种抗病性鉴定标准GB/T 23224—2008,烟草基因组计划重大专项"烟草突变体创制、筛选与分析"建立了烟草抗病毒病、青枯病、黑胫病、赤星病、烟蚜的高通量筛选方法,将全面开展烟草抗主要病虫害突变体的大量筛选与鉴定工作。     

烟草突变体库创制、筛选与分析项目中期检查会议在青岛召开

2011年8月3-7日,烟草基因组计划重大专项2011年研究项目"烟草突变体库创制、筛选与分析"中期检查会议在青岛召开。该项目由中国烟草总公司青州烟草研究所牵头、有关单位共同承担。     

烟草DGAT3基因响应冷胁迫应答的功能研究

二脂酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是催化三脂酰甘油（TAG）合成途径的关键酶,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的作用。本研究从普通烟草品种K326中克隆得到NtDGAT3基因,利用荧光定量PCR技术分析不同组织中和低温胁迫下NtDGAT3的表达规律。同时,利用CRISPR/Cas9技术制作NtDGAT3敲除植株,对其耐冷性进行了分析。结果表明,NtDGAT3在烟草根、茎、叶中均有表达,且叶部表达量最高;NtDGAT3受冷胁迫强烈诱导,说明该基因可能对冷胁迫有响应。低温处理试验结果表明,敲除突变体ntdgat3对冷敏感,突变体叶片离子渗漏率及丙二醛含量的变化幅度显著高于野生型烟草;在ntdgat3中,膜脂代谢关键基因PLDα1的表达水平显著高于野生型烟草,而PLDδ的表达水平显著低于野生型烟草。以上结果表明,NtDGAT3基因通过PLDα1和PLDδ的表达参与调节植物低温响应。     

抗二氯喹啉酸烟草材料的筛选与鉴定

为获得抗二氯喹啉酸的烟草育种材料,本研究通过叶面喷施不同浓度二氯喹啉酸,研究受药害烟株叶面积变化规律和烟草药害等级情况,确定喷施二氯喹啉酸对烟草苗期药害的临界浓度及适宜观测时间,并对烟草EMS突变体材料进行规模化筛选鉴定。结果表明,喷施处理引起烟草药害的临界浓度为0.5 mg/L,超出临界值浓度,烟草叶片会出现明显药害症状;为获得较高抗性的突变体材料,以1 mg/L为最适施药浓度,在药害症状明显时（施药后14 d）进行观测,获得了多个对二氯喹啉酸高抗、中抗及敏感的突变体材料。对高抗材料QR-19的杂交一代株系抗性分析显示,该材料对二氯喹啉酸的抗性可能受隐性基因控制。本研究为解析烟草对二氯喹啉酸等激素型除草剂的抗药性机理及除草剂抗性育种奠定了材料基础。     

烟草赤星病菌嘧菌酯抗性突变体的诱导及其生物学特性

为探究烟草赤星病菌对嘧菌酯的抗药性风险水平,通过对烟草赤星病菌在室内含药平板上的菌丝药剂驯服和分生孢子紫外诱变,进行突变体的生物学特性的研究,并对突变体靶标基因细胞色素b进行了测序分析。获得了4株嘧菌酯抗药性突变体。其中,菌丝药剂驯服未获得突变体;孢子紫外诱变获得4株突变体,突变率约为0.004%,突变体抗性倍数分别为42.50、282.50、515和107.50。4株突变体均降低了对嘧菌酯的敏感性。适合度研究表明,抗药性突变体具有同敏感菌株同样的分生孢子萌发能力和致病能力;菌丝生长速率较敏感菌株有所降低,3株突变体的分生孢子产量较敏感菌株增强,1株突变体较敏感菌株减弱。抗药性靶基因细胞色素b基因部分序列分析表明,突变体在129位和143位的碱基与敏感菌株完全相同,未发生任何突变。初步认为烟草赤星病菌对嘧菌酯的抗性风险水平较低。     

烟草BELL基因家族鉴定及其温室条件下的表达模式分析

BELL基因是植物中普遍存在的一类基因,其编码的同源异型结构域转录因子参与调控了植物叶片、花序等多个组织的发育过程。为明确烟草BELL基因的结构和功能,通过同源序列比对和功能域分析鉴定了普通烟草BELL基因,结合系统进化和基因表达模式分析对烟草BELL基因的功能进行了初步预测。结果表明,从普通烟草基因组中共鉴定出28个NtBELLs基因,分布于15条不同的染色体上。系统进化分析表明,烟草NtBELLs基因可分为4组,每组参与调控烟草不同的发育过程。NtBELLs基因在6个烟草组织中呈现不同的表达模式,且具有明显的组织特异性。干旱和盐胁迫能显著诱导部分NtBELLs基因的表达,表明该基因家族可能参与了植物抵御非生物胁迫的过程。     

电子鼻检测和定量表达分析相结合对烟草香气突变体进行鉴定

香气对烟草品质具有决定性的作用。我国的烟草品种普遍存在香气量不足的问题,对现有种质进行创新很有必要。诱变育种是创制新的种质资源的有力工具。本研究使用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导中烟100产生突变,从中筛选获得5个香气突变体fgr1-fgr5。与中烟100相比,这5个突变体表现出不同的成熟性状和较高的腺毛密度。为进一步鉴定突变体的香气性状,采用PEN3型电子鼻检测了突变体和中烟100的新鲜烟叶和烤后烟叶的挥发性香气成分,并对电子鼻响应值进行主成分分析和聚类分析。结果显示,可将突变体分为两种类型:"晾晒烟类型"和"烤烟类型",这两种类型的突变体具有不同的香气指纹图谱。对香气代谢途径中5个关键酶基因进行荧光定量表达分析,发现两种类型的突变体在基因表达水平上具有较大差异,表明它们在香气代谢相关途径中具有不同的基因表达调控机制。     

利用HRM技术快速筛选低镉烟草突变体

低镉烟草种质资源对烟草育种及烟叶安全具有重要意义。本研究利用EMS处理贵烟1号获得诱变群体，按株系种植2020个M₂株系，每株系种植10株，株系内3株叶片混样提取DNA，并采用HRM技术对样本池筛选烟草镉转运基因NtHMA4突变体，共获得49份疑似突变材料。DNA测序鉴定发现，其中21个株系发生SNP突变，其中15个为错义突变，其余为同义突变。对突变体与和野生型材料叶片的镉含量分析发现，有8份突变体的镉含量较野生型显著下降（16.19%~42.08%）。利用HRM技术跟踪检测10份种子可正常萌发的错义突变体M₃家系，结果表明，HRM技术不仅可快速筛选烟草EMS诱变群体中的突变材料，结合DNA测序也可进一步对突变杂合体后代进行快速、准确的基因分型。      

烟草抗病毒相关R基因RNAi 表达载体的构建

RNA 干扰介导的基因沉默是植物抗病育种和大规模分析功能基因快速而有效的方法。构建烟草抗病毒病相关 R 基因的RNAi表达载体并导入烟草可获得抗病毒病烟草材料,并为大规模分析鉴定烟草功能基因提供新方法。本研究利用绒毛状烟草基因组测序获得的 R 基因序列设计引物,通过 PCR 技术扩增出带有特异性结合位点 attB 的 R 基因部分序列。采用GATEWAY 方法将目的基因的干扰片段插入到表达载体 pH 7 GWIWG2(I),成功构建了烟草抗病毒病相关 R 基因的 RNAi表达载体。     

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用,本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子,其Dof功能域在进化上十分保守,根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明,烟草中的16个Dof基因与拟南芥17个Dof基因有27个共线性基因对,同时,25个Nt Dof基因被检测到存在17个全基因组复制对,表明复制事件在烟草Dof基因家族的扩张中起关键作用。此外,表达模式分析表明Nt Dof基因的表达存在明显的组织特异性,其中NtDof05和NtDof28基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析,为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。     

烟草突变体筛选与鉴定方法篇:4.烟草抗干旱突变体筛选与鉴定

烟草经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理可以分离得到多种突变体,这些突变体的获得将为揭示烟草生长发育规律奠定基础。烟草突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前体,而筛选方法是突变体筛选成败的关键。干旱是影响植物生长发育的主要环境因子之一[1]。烟草在生长过程中,特别是从团棵期进入旺长期常常遭遇干旱,干旱已经成为影响其营养生长的重要因素。利用突变体材料筛选烟草抗旱突变体,不仅可为     

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶,在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员,本研究通过生物信息学的方法,在普通烟草基因组中共鉴定出了15个TPP基因,其中7个TPP基因定位在染色体上。系统进化分析发现,新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族,分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ。共线性分析表明,有5个烟草Nt TPP基因分别与7个拟南芥AtTPP基因形成同源基因对。启动子分析发现,NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现,NtTPP基因表达具有一定的组织特异性,大部分NtTPP基因在根中的表达量最高,有12个NtTPP基因在干旱胁迫下表达量上调,13个NtTPP基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。     

拟南芥花期基因转化烟草及其早花反应特性研究

为探讨花期基因对烟草开花早晚的影响及其在加快育种进程中的利用价值,采用RT-PCR方法从拟南芥克隆获得花期基因(FT),经过测序分析、酶切鉴定后连接到植物表达载体P22上,构建植物重组载体P22-FT。通过农杆菌介导,将FT基因转入烤烟品种Coker 371 gold后获得了26株阳性植株。研究结果表明,FT基因对烤烟品种Coker 371 gold的外观形态和花期具有较大的影响;与未转基因对照比较,FT阳性植株平均叶片数少15~16片,平均株高矮80 cm,现蕾时间提前了75 d左右。通过阳性植株自交分离群体及阳性植株与对照植株的杂交分离群体的鉴定选择,获得了单拷贝FT基因的2个阳性植株。早花基因转化烟草可以有效诱导烟草早花,缩短烟草生育期一半时间,单拷贝可分离早花植株在加快烟草育种进程中具有重要利用价值。     

普通烟草SBP转录因子家族的全基因组鉴定及其进化和表达分析

SBP转录因子家族作为植物特异性的转录因子具有重要的生物学功能,广泛参与花和果实发育等诸多生命过程。利用普通烟草(Nicotiana tabacum)TN90基因组数据,通过隐马尔科夫模型检索,SMART和Pfam分析,鉴定了普通烟草SBP转录因子家族成员;通过多序列比对鉴定并分析了普通烟草SBP结构域的结构特征;通过邻接法、极大似然法进行了系统发育分析;分别利用GSDS和MEME对SBP转录因子家族成员的基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;利用普通烟草TN90转录组数据分析了SBP转录因子家族成员在不同组织和时期的表达情况,并对鉴定出的SBP转录因子家族成员进行了GO注释分析。结果表明,普通烟草基因组编码32个SBP转录因子家族成员,氨基酸序列长度差异较大;系统发育分析表明,所有的SBP转录因子家族成员可分为8个亚家族。转录组数据显示,SBP基因家族成员在不同组织和时期中表达迥异,但在花器官中均有较高的表达量。GO注释结果表明,该家族成员作为转录因子,在植物的生长发育、逆境响应等过程中发挥作用。本研究为烟草及其他植物中SBP转录因子家族基因的鉴定和功能研究提供了基础。     

研究人员发现调控植物分枝形成基因

<正>植物分枝的多少,是植物在形态上适应环境的一种非常重要的方式,还可以影响粮食产量。那么植物的分枝是如何形成的呢?分枝形成的过程又是如何调控的呢?北京大学秦跟基课题组发现了一个重要的调控植物分枝的基因。相关成果日前发布于《植物细胞》。一些名为"腋芽分生组织调控因子"(RAX)的MYB类转录因子对干细胞形成起非常重要的作用。科学家通过正向遗传学方法鉴定了一个促进植物分枝增多的基因,命名为"过多分枝"(EXB1)。在突变体中EXB1基因的表达量升高,植物就长出很多分枝,而且有些叶腋处长出更多个初级分枝和更高级分枝,甚至在子叶的叶腋处也能长出分枝。这说明EXB1基因可促进腋芽干细胞的形成,甚至可以在正常     

普通烟草Aux/IAA转录因子家族全基因组鉴定分析

Aux/IAA是一种生长素早期响应因子,影响生长素对植物生长发育的调控。烟草作为一种模式植物,在烟草中鉴定Aux/IAA家族基因对于研究生长素调控机制具有重要意义。本研究利用生物信息学方法,从普通烟草基因组中鉴定出77个Aux/IAA家族基因,平均氨基酸数为379,全部为亲水性蛋白,大部分为酸性蛋白。其中46个基因定位到19条连锁群上,分布最多的22号连锁群上有6个基因,其余31个基因位于Scafford上,所有基因均定位于细胞核内。Aux/IAA家族划分为2个类群,10个亚群,包括6对直系同源和40对旁系同源姐妹对,每个亚群中都分布有烟草的Aux/IAA基因。所有的烟草Aux/IAA基因均缺失了结构域Ⅰ,68个基因同时包含Aux/IAA结构域Ⅲ和Ⅳ,21个B6亚组基因包含B3、ARF和Aux/IAA结构域。内含子-外显子结构除了B6亚组基因外,都较为简单。表达模式分析结果显示,不同亚群的基因组织表达特异性不同,同一亚群的基因组织表达特异性一致。Aux/IAA家族基因主要参与细胞组成、蛋白结合、生物进程调节、信号转导、刺激反应、代谢过程等功能。