家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

家蚕一个DDRGK超家族成员的克隆及分析

DDRGK类蛋白是在动物及植物中发现的约有300个氨基酸残基的蛋白家族,含有一个高度保守的DDRGK基序,但功能还未知。在对家蚕幼虫cDNA文库的测序中发现了含有该保守结构域的EST序列,经过电子克隆、RT-PCR,获得该基因完整的cDNA序列,将其命名BmDDRGK(GenBank登录号FJ645927)。然后构建了重组质粒转化到大肠杆菌BL21和Rosetta中诱导表达,但经SDS-PAGE检测未检测到重组蛋白的表达。利用Real-timePCR技术对BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期不同组织的mRNA表达水平进行了鉴定。绝对定量结果显示BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期的各个组织中均有较为明显的表达,在五龄幼虫期,以中肠、马氏管、睾丸表达量较高,在蛹期,以翅原基、睾丸的表达量较高。     

信号肽引导源基因在昆虫表达系统中的分泌表达

将杆状病来源的gp67信号肽引导的慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因与植物来源的慈姑蛋白酶抑制剂信号肽引导的慈姑蛋白抑制剂(API)基因，分别克隆到昆虫杆状病毒转载体pBacPAK8中，通过共转染将它们分别整合到昆虫病毒表达载体Bm—BacPAK6中，将获得的重组病毒CrBK—API2和CrBK—bpAPI4分别接种家蚕(Bombyx mori)细胞、家蚕幼虫及蛹体中，慈姑蛋白酶抑制剂得到了高效表达。从家蚕细胞的表达来看，外源表达产物大多存在于细胞外的上清液中；从家蚕幼虫体内表达来看，信号肽能引导外源基因高效表达，且表达产物的90％以上能分泌到细胞外；蛹体中的表达情况与幼虫中的相似，但表达产物出了不均一的现象，从表达产物的分子量测定来看，这两种信号肽在表达过程中都没有被切除。     

拟南芥ago1-27突变体的RNA-seq分析

miRNA在植物生长发育和环境适应等方面起着极为重要的作用.本研究对拟南芥ago1-27突变体进行了RNA-seq,鉴定到几千个差异表达基因,并且miRNA靶基因倾向于在ago1-27中表达上调.ago1-27 RNA-seq结合降解组分析鉴定到新的miRNA靶基因,如miR396靶向半胱氨酸蛋白酶基因和miR167靶向编码AT-hook DNA结合蛋白的基因等.     

莱茵衣藻硫胁迫相关microRNA检测及其靶基因分析

采用特异反转录引物,构建莱茵衣藻microRNA(miRNA)的cDNA文库.选用U4核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)作为内参,用SYBR(R)green RT-PCR对3种与莱茵衣藻缺硫胁迫反应相关的miRNA进行检测,利用在线平台软件Web MicroRNAs Designer(WMD3)对miRNA靶基因进行预测.结果表明,在缺硫胁迫下,3种miRNA(miRNA1145.2、miRNA1146和miRNA1158)的表达水平均明显上调,与正常培养的莱茵衣藻表达miRNA的相对丰度比值分别为3.11、2.38和3.67.靶基因预测分析表明,miRNA1145.2能影响脂肪酸氧化反应,miRNA1146与辅酶Q代谢相关,miRNA1158可能参与磷酸戊糖途径调控.     

基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法

研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。     

拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一类长度为20~24核苷酸(nucleotide,nt)的非编码的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),在植物生长发育过程中具有重要作用.为鉴定参与植物miRNA合成、降解和运输等通路的因子,利用拟南芥转基因株系SUC2:amiR-SUL进行正向遗传筛选体系,通过对该株系进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)诱变筛选获得SUP-E45突变体.对该突变体进行表型观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和全基因组测序实验.结果显示,突变的基因为Ago1(Argonaute 1),该基因编码的AGO1蛋白是miRNA通路中至关重要的蛋白,成熟的miRNA与AGO1蛋白结合形成miRISC沉默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)从而对靶基因的表达进行负调控.验证了该筛选体系的可行性.通过该筛选体系可筛选出其他参与miRNA合成、影响miRNA活性或miRNA运输等通路的因子,为后续拟南芥miRNA通路的研究奠定了基础.     

LC-1 ScFv偶联GFP基因的构建及表达

从具有高效蛋白表达及活力的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株（LC-1）抽提总RNA，反转录成cDNA。根据肿瘤单链抗体（ScFv）基因设计引物，用多聚酶链式反应（PCR）克隆出抗体的重链和轻链基因，并通过重叠延伸PCR法将重链基因与修饰后的轻链基因连接为单链抗体基因。改造后的ScFv与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建表达质粒ProGFP-ScFv，随后转化大肠杆菌JM109，用诱导剂IPTG进行诱导表达。表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化，进行SDS-PAGE电泳分析其纯度。酶联免疫检测（ELISA）表明该蛋白已具有抗体活性。395 nm激光激发显示绿色荧光，表明目的基因在原核生物中存在表达。     

盐藻microRNAs高通量测序和生物信息学分析

小核糖核酸(microribonucleic acid,microRNA或miRNA)是一类内源性长约21~24个核苷酸碱基(nucleotide,nt)的非编码RNA,在真核生物的基因转录后调控中起着重要作用.杜氏盐藻(Dunaliella salina)是β-胡萝卜素含量最高的真核微藻,为探究其是否存在内源miRNA,构建了小RNA文库,通过Illumina HiSeq~(TM)2500高通量测序的方法对盐藻进行小RNA测序.测序共获得11 542 169条clean tags(3个盐藻文库clean tags数的平均值).比对Gnen Bank数据库、Rfam数据库及盐藻的参考基因组数据,筛选后的clean tags数据再比对miRBase数据库,3个盐藻生物学重复分别获得已知miRNA为42、41和44个.比对盐藻参考基因组及其miRNA前体发卡结构预测,3个重复分别获得盐藻新的miRNA为920、880和957个.预测所有miRNA的靶基因,并对其进行功能富集,发现靶基因在细胞代谢进程、分子功能的结合和催化活性方面较多.首次鉴定了杜氏盐藻中具有miRNA的存在,对揭示miRNA这一调控机制广泛存在于单细胞真核绿藻提供了依据.     

莱茵衣藻CrDRBs基因的克隆和生物信息学分析

双链核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)结合蛋白(double-stranded RNA-binding protein,DRB)是一类含有双链RNA结合结构域(dsRBD)的蛋白,在小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA或miRNA)的生物合成和作用方式选择方面起着重要作用.为获得莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)中所有CrDRBs的全长序列并进行生物信息学分析,从蛋白质功能结构域Pfam数据库中下载了dsRBD结构域模块,使用HMMER软件基于dsRBD检索C. reinhardtii全基因组序列,获得C. reinhardtii中4个含dsRBD结构域的CrDRB蛋白相关信息.抽提C. reinhardtii总RNA,反转录获得其cDNA,设计相应引物克隆获得其完整的基因ORF序列.设计实时荧光定量PCR引物,以actin基因为内参,分析C. reinhardtii各CrDRBs基因的相对表达.同源比对分析C. reinhardtii各CrDRBs蛋白的dsRBD序列.通过Phyre2软件在线预测其dsRBD的高级结构.将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD与拟南芥的5个DRB成员构建系统进化树分析,初步探讨分析莱茵衣藻CrDRBs各成员的的进化保守性.本研究共获得了4个莱茵衣藻双链RNA结合蛋白,均具有典型的dsRBD结构域,含有3个保守氨基酸.相比已报道的DUS16,其他3个CrDRBs的CDS序列较长,基因表达较高(除CrDRB2外).本研究为下一步揭示莱茵衣藻CrDRB在miRNA调控途径的功能奠定基础.     

家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究

利用杆状病毒表面展示技术,构建展示SARS-CoV的棘突蛋白（spike protein）受体结合结构域（receptor binding domain,RBD）的重组杆状病毒vBmgp64-RBD,并进一步研究其展示目的蛋白的免疫原性。结果表明：RBD蛋白正确表达并成功展示在病毒囊膜表面,将灭活的纯重组杆状病毒vBmgp64-RBD皮下注射BALB/c小鼠能产生抗RBD蛋白的特异性抗体,且抗体具有抗RBD蛋白的中和作用。证明vBmgp64-RBD有可能作为一种基于杆状病毒的新型SARS疫苗,为SARS的体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础。     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25（217AA）和Pys48（455AA）,以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

影响RNA芯片探针杂交效率的因素分析

RNA芯片作为研究ncRNA的主要技术之一,已受到广泛关注。然而因RNA芯片中靶序列的单链特征,使得RNA芯片的探针设计比DNA复杂。本研究对加强型绿色荧光蛋白（EGFP）RNA序列进行覆瓦式探针设计,制作了RNA原位合成芯片,研究探针／靶序列杂交双链△G和Tm、靶序列二级结构以及探针的末端碱基对RNA芯片杂交信号强度的影响。结果表明,探针／靶序列杂交双链△G和Tm相同的探针间的杂交信号存在较大差异,探针／靶序列杂交双链△G和,Tm与RNA芯片杂交信号之间未发现明显的规律性;靶序列二级结构的探针PT-sc参数与芯片杂交信号强度间呈较好的线性关系;探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号强度也有影响,5’末端碱基为6／C的探针杂交信号总体上高于其邻近的5’末端碱基为A／T的探针的杂交信号,为RNA芯片的探针筛选提供一定的理论基础。     

基于二阶马尔科夫模型预测可趋近性靶基因

miRNA是一类重要的基因表达调节因子。准确预测miRNA的靶基因对研究miRNA的功能和作用机制至关重要。文中提出一种考虑靶位点可趋近性（accessibility）的miRNA靶基因预测算法。算法首先选择满足种子互补条件的＂部分可趋近性＂位点;然后用二阶马尔科夫模型计算与miRNA种子区互补的特定核苷酸片段（寡聚体）在3＇UTR任意位置上出现的概率并统计＂部分可趋近位点＂上寡聚体出现的次数;采用过表达水平值评估一个或多个互补位点上至少出现一次寡聚体的概率;最后根据过表达水平值排序miRNA-3＇UTR对,并取排序的前个miRNA-3＇UTR对作为预测结果。在果蝇和人类数据集上测试的实验结果表明此算法具有较高的灵敏性和精确性。     

三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域（P-D2）,并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。     

RNA干涉和小干涉RNA

RNA干涉(RNA interference.RNAi)可以抑制诸多真核基因的表达,小干涉RNA(small intmference
RNA,siRNA)是RNA干涉的引发物，不同的siRNA可以引导不同水平的RNA干涉，不同种细胞中siRNA的寡核苷
酸链的性质也有很大的不同.非编码RNA中的微小RNA(micnoRNA,miRNA)与siRNA在结构及作用方式等方面有
很多区别和联系.RNAi的作用机制大致有两种：在Drosophila中的一般作用模式和在C.elegans中的扩大作
用模式.利用RNA干涉技术可以通过抑制基因的表达来研究其功能；RNA干涉作为基因治疗的工具，在肝炎
和AIDS的治疗过程中有一定的作用.RNAi的高特异性、高效性、放大效应和无细胞特异性等特点在科研中
得到了广泛的应用.     

siRNA分子设计研究进展

为了设计高效的siRNA（Short-interfering Ribonucleic Acid）分子、最大限度地减少siRNA分子的脱靶效应（off-target effects）,siRNA分子设计已经成为热门研究领域。siRNA分子设计主要是基于序列和能量特征,以及靶标的二级结构特征,基于这些特征设计的siRNA分子已经有了较高的抑制基因表达的效率。RNAi（RNA in-terference）在基因发现以及疾病治疗领域已有非常广泛的应用,就siRNA分子设计近年的研究进展作一综述,为今后siRNA研究提供参考。     

q为偶数次本原单位根时量子群Uq（m，n）的区块结构

研究了当q为偶数次本原单位根时,限制量子群Uq（sl2）在关系K2r=1,Emr=0,Far=0下的商代数Uq（m,n）构造。给出了Uq（m,n）的区块结构,并详细研究了它的正合序列,这样就把Uq（m,n）的表示归结为带关系的Quiver的表示。     

响应面法优化蚕沙中叶绿素的微波提取工艺

为了节能、高效地从蚕沙中提取叶绿素,采用2∶1丙酮乙醇溶液为提取剂辅以微波处理,利用响应面法（RSM）优化工艺条件。在单因素试验的基础上,通过Box-Behnken中心组合试验设计（BBD）进行响应面分析。结果表明,微波提取蚕沙中叶绿素的最佳工艺条件为：微波辐射59 s,提取溶剂与蚕沙用量比例（液料比）27 mL/g,提取时间26 min,提取温度70℃,叶绿素提取率预测值为4.41 mg/g,验证值为4.26 mg/g,与预测值的相对误差为3.4%,与传统有机溶剂法相比,提取率提高了4.8倍。