传统发酵蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选与鉴定

目的:从来源于传统发酵蔬菜的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成有抑制作用的菌株。方法:采用牛津杯打孔法筛选乳酸菌菌株,测定其对N酰基高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子的降解率。利用96孔板法测定其对生物膜的抑制率,应用光镜和扫描电镜观察其对生物膜形成的影响。最终通过生理生化试验和16S rRNA序列分析鉴定乳酸菌菌株。结果:分离自安徽绩溪酸豆角的菌株AJS2-4对嗜水气单胞菌群体感应有抑制作用,当其代谢产物粗提物质量浓度为4 mg/mL时,对嗜水气单胞菌AHLs的降解率为49.36%,对其生物膜抑制率为32.25%;当其质量浓度达到8 mg/mL时,可使嗜水气单胞菌的AHLs完全降解。该粗提物经121℃处理30 min活性基本不变,蛋白酶处理使其活性完全丧失,可初步判定菌株AJS2-4粗提物中的抑制群体感应活性成分为蛋白类物质,且具有热稳定性。光镜结果显示:菌株AJS2-4粗提物可有效抑制嗜水气单胞菌生物膜的合成。扫描电镜结果显示:菌株AJS2-4粗提物不仅能有效降低其生物膜的生成量,还可使其结构破裂变得疏松。经生理生化和16S r RNA鉴定菌株AJS2-4为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。结论:从安徽绩溪酸豆角中获得1株抑制嗜水气单胞菌群体感应和生物膜形成的植物乳杆菌AJS2-4。     

鱼类肠道中抑制哈维氏弧菌群体感应及生物膜形成的乳酸菌的筛选和鉴定

从鱼类肠道来源的乳酸菌中筛选对目标菌—哈维氏弧菌群体感应及生物膜形成具有抑制作用的菌株。采用牛津杯打孔法从30株乳酸菌中筛选5株具有抗群体感应活性的菌株,其中源自鲤鱼肠道的菌株LY3-1的抑制效果较好,抑菌圈直径达14.21 mm。当菌株LY3-1粗提物质量浓度为8.0 mg/mL时,目标菌酰基高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子的降解率为41.7%,生物膜抑制率为69.8%;当粗提物质量浓度为16.0 mg/mL时,可完全降解AHLs信号分子,生物膜抑制率达90.6%。菌株LY3-1粗提物经蛋白酶处理,群体感应抑制活性丧失,表明该粗提物中抑制群体感应的活性物质是蛋白质类物质。粗提物经40～121℃处理30 min,其群体感应抑制活性无显著性差异(P0.05),说明其具有热稳定性;同时,该粗提物在pH 3.5～7.0范围具有群体感应抑制活性。光镜和扫描电镜结果表明:菌株LY3-1粗提物对哈维氏弧菌生物膜形态结构具有显著破坏作用。菌株LY3-1经生理生化反应和16S rRNA测序被鉴定为乳酸乳球菌,其可作为哈维氏弧菌群体感应抑制剂。本研究结果为研发革兰氏阴性菌群体感应抑制剂提供理论基础。     

滤纸片法筛选抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌及抑制作用分析

采用滤纸片法从传统发酵蔬菜中筛选抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌菌株,应用96?孔板法测定其对生物膜的抑制率,光学显微镜和扫描电镜观察其对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响,同时以蛋白酶、嗜铁素、群集及泳动为指标研究其对嗜水气单胞菌毒力作用的影响。结果表明：来源于辽宁锦州酸菜的乳酸菌菌株SCT-2对嗜水气单胞菌群体感应有明显抑制作用,当其代谢产物粗提物质量浓度为8?mg/mL时,对嗜水气单胞菌生物膜抑制率为45.16%,光学显微镜下显示菌株SCT-2粗提物可有效抑制嗜水气单胞菌生物膜的形成,扫描电镜结果进一步表明菌株SCT-2粗提物不仅降低了嗜水气单胞菌生物膜的生成量,而且使其生物膜断裂。8?mg/mL的SCT-2粗提物可使嗜水气单胞菌蛋白酶和嗜铁素的分泌量分别减少27.18%和22.11%,对信号分子的降解率为32.27%,且对嗜水气单胞菌的群集和泳动现象抑制明显。经生理生化和16S?rRNA鉴定菌株SCT-2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。从传统东北酸菜中获得对嗜水气单胞菌群体感应有抑制作用的植物乳杆菌SCT-2,为开发一种抑制嗜水气单胞菌群体感应的乳酸菌生物制剂提供了理论支持。     

大菱鲆源荧光假单胞菌群体感应淬灭酶基因的克隆及生物信息学分析

导致水产品腐败变质的微生物之间存在一种信息交流机制，称之为群体感应。革兰氏阴性细菌群体感应系统主要由N-酰基高丝氨酸内酯作为信号分子，在水产品中间接调控一些腐败菌的致腐特性。可通过淬灭群体感应来抑制水产品的腐败。作为群体感应抑制剂的群体感应淬灭酶在许多细菌中被鉴定出来。为探究荧光假单胞菌PF08的pf-1240基因表达产物的潜在功能，通过基因克隆和生物信息学分析对其进行研究。结果表明:荧光假单胞菌PF08的pf-1240基因能编码一种群体感应淬灭酶，与铜绿假单胞菌PAO1的第2个高丝氨酸内酯酰化酶QuiP蛋白的相似性为65.82%。序列分析显示:pf-1240基因共编码795个氨基酸，蛋白分子式为C3867H6010N1084O1160S19，相对分子质量86 855.96，理论等电点为7.81，不稳定系数为35.29，属于亲水蛋白。由保守结构域分析可知，该蛋白包含一个完整的青霉素酰化酶家族结构域且该家族中有许多酶被证实具有群体感应淬灭酶功能，能够分解长链群体感应信号分子AHLs。推测该蛋白也具有类似的群体感应淬灭酶功能。本研究借助生物信息学技术对其理化性质、结构等情况进行预测分析，以便深入了解荧光假单胞菌群体感应淬灭酶的性质和功能。     

传统腌渍蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选

从传统腌渍蔬菜分离的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成具有抑制作用的菌株。采用牛津杯打孔法从21株乳酸菌中筛选出具有抑制活性的6株乳酸菌,其中分离自辽宁大连酸黄瓜的菌株DLH513效果较好。当菌株DLH513粗提物质量浓度为16.0 mg/mL时,对嗜水气单胞菌AHLs信号分子降解率为51.1%,对其生物膜抑制率为40.9%;当粗提物质量浓度为20.0 mg/mL时,可使其AHLs信号分子完全降解。应用不同蛋白酶处理菌株DLH513粗提物后,对嗜水气单胞菌群体感应无抑制作用,表明其粗提物具有蛋白特性;在40～121℃处理30 min,其粗提物仍具有抑制群体感应活性,表明其粗提物具有耐热特征;在pH 3.0～4.5范围,菌株DLH513粗提物表现出抑制群体感应活性,在酸性条件下较稳定。光镜和扫描电镜结果表明,菌株DLH513粗提物对嗜水气单胞菌生物膜形成有显著的破坏作用。经生理生化反应和16S r RNA鉴定菌株DLH513为植物乳杆菌。研究表明植物乳杆菌DLH513可作为革兰氏阴性菌群体感应的抑制剂,以期为研发一种新的用于控制引起食品腐败和食源性疾病的革兰氏阴性菌群体感应的抑制剂提供理论基础。     

群体感应抑制剂3,4-二溴-2（5H）-呋喃酮对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

为了研究3,4-二溴-2（5H）-呋喃酮（3,4-dibromo-2（5H）-furanone,DF）对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用。通过在24孔板和硅胶片上构建生物膜模型,CFU计数法测定DF对荧光假单胞菌的最低抑制浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）和最低杀菌浓度（Minimum Bacterial Concentration,MBC）以及生物膜生长曲线,在1倍MIC和5倍MIC的DF作用下的荧光假单胞菌生物膜形成率和细菌群集运动能力,并探讨DF对荧光假单胞菌总蛋白合成及多糖含量的影响。结果表明,DF对荧光假单胞菌作用的MIC和MBC值分别为12.5μg/m L和800μg/m L;在DF浓度为1 MIC和5 MIC时,作用于荧光假单胞菌24 h生物膜形成抑制率分别为20.59%±2.91%和99.54%±1.83%,并能明显抑制荧光假单胞菌的群集运动能力,干扰荧光假单胞菌群体感应（Quorum sensing,QS）系统而影响其总蛋白合成及多糖的含量,24 h时5 MIC的DF对荧光假单胞菌总蛋白和菌多糖合成量的抑制率分别为8.04%±0.37%和51.08%±2.71%。本研究对DF影响荧光假单胞菌生物膜形成的原因,DF对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其对QS通路的干扰具有良好的理论和实践参考。      

戊糖片球菌YF-8对温和气单胞菌毒力因子及生物膜的影响

温和气单胞菌是水产品中常见的腐败菌,其致腐机制与群体感应密切相关,寻找淬灭群体感应的活性物质可以有效控制其致腐能力。本文选择对温和气单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子具有降解活性的戊糖片球菌YF-8,研究其对温和气单胞菌毒力因子、生物膜及群体感应调控基因的影响。结果表明：亚最小抑菌浓度的YF-8乙酸乙酯粗提物（2.0,4.0 mg/mL和6.0 mg/mL）对温和气单胞菌蛋白酶、胞外多糖、嗜铁素、溶血性、泳动能力的抑制率分别为9.6%～32.72%,17.91%～58.09%,19.04%～44.35%,19.21%～51.49%,51.61%～93.55%,且呈质量浓度依赖性。此外,3个亚最小抑菌浓度的YF-8粗提物对温和气单胞菌生物膜形成抑制率和清除率分别为31.28%～66.64%和6.7%～29.88%,结构上可使其厚度变薄,菌体稀疏、松散。6.0 mg/mL的YF-8粗提物可使温和气单胞菌群体感应调控基因LuxI和LuxR的相对表达量分别下调69.48%和80.76%。本研究为控制由温和气单胞菌导致的水产品腐败及病害提供了新的思路。     

富马酸钠对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败活性的抑制作用

以报告菌株紫色杆菌CV026为检测模型,探究富马酸钠对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的影响。采用酶标法及光学显微镜观察富马酸钠对荧光假单胞菌生物被膜的抑制效果,利用气相色谱-质谱分析富马酸钠对荧光假单胞菌分泌信号分子的影响。结果表明：在亚抑菌浓度下,富马酸钠可以显著降低紫色杆菌CV026紫色菌素的产生量（P＜0.05）;当质量浓度为2.0 mg/mL时,富马酸钠对紫色菌素的抑制率达50.95%,且不影响CV026菌株的生长。富马酸钠能有效抑制荧光假单胞菌生物被膜形成、群集与泳动、胞外蛋白酶活性等相关腐败特性,且质量浓度与其抑制作用呈正相关。另外,由气相色谱-质谱检测结果可知,富马酸钠对荧光假单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯信号分子的分泌有较好的抑制效果。因此,富马酸钠具有较好的群体感应抑制活性,可作为新型群体感应抑制剂用于水产品贮藏保鲜。     

肉桂醛对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

本文拟研究肉桂醛在非抑菌浓度条件下对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）FML05-2生物膜形成的抑制作用。首先测定了肉桂醛对模式细菌紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CVO26紫色素产生的影响;再对荧光假单胞菌FML05-2形成的生物膜以及与生物膜形成有关的重要因素胞外多糖进行了测定。结果表明:在非抑菌浓度40、20μg/m L条件下,肉桂醛对紫色杆菌CVO26紫色素的产生具有抑制作用,抑制率分别为31.53%、17.90%;对荧光假单胞菌FML05-2生物膜形成的抑制率分别为44.22%、21.77%;对荧光假单胞菌FML05-2胞外多糖产生的抑制率分别为15.72%、5.34%。因此,肉桂醛在非抑菌浓度条件下对荧光假单胞菌FML05-2生物膜的形成具有抑制作用。      

植物乳杆菌XCT-1对温和气单胞菌群体感应及生物膜形成的抑制作用

利用双层琼脂扩散法从辽宁葫芦岛农家腌芥菜中获得对温和气单胞群体感应有较强抑制活性的菌株XCT-1,该菌株经生理生化和16S r RNA序列被鉴定为植物乳杆菌。4 mg/mL菌株XCT-1代谢产物的粗提物对温和气单胞菌生物膜的抑制率为38%,显微镜观察显示其粗提物能够减少细菌生物膜的形成。扫描电镜结果表明:菌株XCT-1粗提物不仅降低了温和气单胞菌生物膜的生成量,而且使其生物膜结构疏松。菌株XCT-1粗提物经100℃30 min后其抑制活性保持不变,而经胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶处理后活性完全丧失。初步确定菌株XCT-1粗提物中的群体感应抑制成分为蛋白类物质,具有热稳定性。研究表明菌株XCT-1粗提物中的蛋白类物质主要通过干扰温和气单胞群体感应系统抑制其生物膜的形成。