凝血因子VII高表达细胞的高通量筛选方法

针对哺乳动物细胞表达克隆的耗时较长的筛选过程,作者通过流式细胞仪对细胞进行快速筛选和纯度检测。利用流式细胞仪对电转细胞进行分选,利用点杂交和western blot方法筛选高表达克隆。流式细胞仪分选后的细胞,经点杂交和WB检测后获得的CHO-r FVII-1细胞,表达r FVII细胞的比例为99.9%,同时与传统筛选方法获得的CHO-r FVII克隆比较后发现,两株细胞具有相同的r FVII产量。作者基于流式细胞仪建立了快速筛选高表达重组药物蛋白克隆的筛选的高通量方法和纯度检测的方法,为其他在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的筛选提供参考。     

基于Egfp启动子高通量筛选方法的研究

本研究以载体pUC-19为基础质粒,引入编码增强型绿色荧光蛋白的Egfp为报告基因,选用PGK为启动子,构建重组质粒pUC-PEBBK。通过PCR扩增出重组盒BATs-PGKp-Egfp-PGKt-Kan MX-BATx,将其与酿酒酵母AY15单倍体α5同源重组,获得重组菌株α5-PEBBK。使用荧光显微镜和酶标仪检测EGFP在酿酒酵母中的表达,检测到重组菌荧光强度(RFU)为523,亲本菌株为53,是原菌的10倍,证明Egfp在PGK启动子调控下在酿酒酵母α5中能够正确表达。通过培养基优化,排除了培养基成分酵母浸粉和蛋白胨对绿色荧光蛋白检测的干扰,确定了利于Egfp表达和快速检测的筛选培养基BSM1。考察了接种量和培养时间对Egfp荧光表达和菌体生长的影响,确定了最佳48孔板培养条件为接种量40μL,培养时间为36 h。高效、灵敏的高通量筛选方法的建立为后续系列表达强度启动子的筛选奠定了良好的基础。     

信号肽突变促进透明质酸酶分泌的高通量筛选方法

为了增强透明质酸酶在微生物胞外的分泌表达,本文采用强组成型启动子P43,在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组中整合表达水蛭来源的透明质酸酶,并利用RECODE突变技术构建信号肽突变库,通过高通量96微孔板初筛,将1000株突变株中胞外酶活提高50%以上的20株突变体进行摇瓶复筛,最终获得了三株胞外酶活显著提升的突变株B. subtilis MspLHyalA-C(比野生型LHyal酶活提高55.50%-66.85%),摇瓶中粗酶活最高达到6.04×104 U/mL,为透明质酸酶的定向进化提供了可行性方案。     

高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株

以黑曲霉为研究对象,建立了高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株流程。结果表明:紫外线-LiCl复合诱变处理的黑曲霉孢子悬浮液,高通量筛选得到4株高产菌株,传代后发酵性能稳定。菌株P-9,其发酵液葡萄糖酸钙含量达到23.04 g/100 mL,比原始菌种高5.86 g/100 mL。相较于传统摇瓶发酵筛选工作量大,周期长,该方法显著提高了筛选效率。     

纳他霉素高产突变菌株高通量筛选方法的建立

为了提高纳他霉素（natamycin）高产菌株诱变后的筛选效率,建立一种24孔深孔板/酶标仪发酵初筛和摇瓶发酵复筛的高通量筛选检测方法,得到在24孔深孔板发酵结果与摇瓶发酵有很好的一致性,证实了酶标仪检测可以替代高效液相色谱法检测用于突变菌株的快速高通量筛选。以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus TUST01）作为出发菌株,通过多轮的紫外诱变、常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）以及硫酸二乙酯复合诱变、孔板初筛与摇瓶复筛,从887株突变株中筛选出遗传性稳定的高产菌株S. gilvosporeus Y-4-75,其摇瓶纳他霉素产量（5.95 g/L）与生物量（29.19 g/L）较出发菌株分别提高了31.93%和15.19%。     

普鲁兰酶突变体文库高通量筛选方法的建立及应用

在摇瓶水平实现普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)在大肠杆菌BL21(DE3)的异源表达,并成功按规格缩小实现了基于深孔板的高通量细胞培养,同时建立了基于深孔板的普鲁兰酶酶活快速高效的高通量检测方法。利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化,突变基因产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其表达量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。     

黄茶降脂活性高通量筛选的研究

现代研究表明,PPAR与心血管疾病有着密切关系,该受体已成为血脂代谢异常的主要靶点。主要是以其3种亚型PPARα、PPARγ和PPARβ/δ作为模型,对黄茶水提物(1#)与黄茶醇提物(2#)进行高通量(HTS)活性筛选。筛选结果为:2#样品对激活PPAR受体γ、PPAR受体δ有较为明显的活性,对激活PPAR受体α则没有作用,其激活倍数分别达1.64、1.96。     

长双歧杆菌优势菌株的高通量筛选

本文通过96孔深孔板微型化培养和酶标仪快速检测,建立了简单、快速、准确且自动化水平较高的双歧杆菌高通量筛选方法。经过高通量筛选获得长双歧杆菌优势菌株BL01,其摇瓶发酵活菌数由5.4×10⁸CFU/m L提高到1.53×10⁹CFU/m L,与原始菌株相比约提高3倍;7 L罐发酵活菌数由3.9×10⁹CFU/m L提高到1.67×10¹⁰CFU/m L,约提高4.3倍,且多次传代均能维持在较高活菌水平。此法简单且大大降低筛选成本,对其他微生物菌株的大规模筛选具有重要参考价值。      

苦瓜多糖降血糖活性的高通量筛选研究

PPAR与2型糖尿病存在密切关系,该受体已成为抗2型糖尿病的主要靶点。本文以PPAR三种亚型PPARα、PPARγ和PPARβ/δ为靶点的高通量筛选模型,对苦瓜多糖进行活性筛选。筛选结果表明苦瓜多糖对PPARδ和PPARγ具有较强的激活效果,其激活倍数分别达1.995、1.689。苦瓜多糖是一种潜在的降糖、降脂的活性成分。     

基于TTC染色法的高活力酵母细胞定量筛选

在2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法及96孔板基础上建立高活力与高产乙醇酵母细胞的同步定量筛选方法。选用体积分数为85%二甲基亚砜作为TTF提取剂,培养液(pH8.0)中TTC添加浓度为0.4%,以96孔板在0%、10%、14%的乙醇浓度下培养27株备选酵母菌株,通过酶标仪测定波长486 nm下TTF吸收值。结果显示TTF吸收值越高,酵母活性越高,并且通过比较酵母活性与其乙醇产量,得出两者在一定程度上呈正相关,即高活性酵母其乙醇产量也较高。共筛得6株具有较高细胞活性的菌株。此方法为高活性、高产乙醇酵母及其他微生物及植物细胞的活性的快速、大量检测提供了一条新途径。     

产脂肪酶菌株的常压室温等离子体诱变及高通量筛选方法的建立

脂肪酶由于可催化的反应种类和底物类别多,且具有位置选择性和异构体选择性等特点而常用于结构酯的合成和油脂改性等领域。丝孢酵母(Trichosporon sp.)是一种产脂肪酶菌种,但生产能力偏低是限制该菌实现工业化生产的重要因素。本研究利用常压室温等离子体(ARTP)对丝孢酵母野生菌进行诱变处理,并建立了96孔板培养结合对硝基苯酚棕榈酸酯(P-NPP)法测定酶活力的高通量筛选方法,实现了60个突变菌株的初筛。以酶活力为筛选指标时,突变率和正突变率分别为51.7%和28.3%。8株初筛菌株的摇瓶发酵结果显示,A13和A5的产酶提高最显著,培养96 h后分别比野生菌增加2.64倍和1.54倍,且2个突变菌株的遗传稳定性良好。对比研究发现,突变菌株A13相较野生菌的最大优势在于提前24 h便能达到最高产酶量。     

surfactin高产菌株的等离子体诱变及其高通量筛选

利用常压室温等离子体(atmospheric pressure and room temperature plasma,ARTP)方法对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis E7进行快速诱变,筛选表面活性素(surfactin)高产菌株。采用表观初筛,溶血圈初筛,孔板复筛,多功能酶标仪检测,摇瓶验证相结合的方法提高了筛选通量,加快了筛选进程,构建了高通量诱变筛选surfactin高产菌株的体系,并使用高效液相(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法对产物进行检测。优化处理时间为220 s,获得了遗传稳定的突变菌株Bacillus subtillus SF90-5,其产surfactin能力提高到约0.8 g/L,是原始菌株的5倍。ARTP诱变技术结合高通量筛选体系极大程度减少了工作量,提高了筛选通量,加快了筛选进度,并快速获得了目的菌株,为脂肽类表面活性剂进一步的工艺研究提供了基础。     

用于高通量筛选蛋白酶的氨基酸间接荧光测定法

建立了一种用间接荧光分析快速测定氨基酸的新方法.Cu2+与钙黄绿素结合成钙黄绿素-Cu2+后发生荧光淬灭,氨基酸与Cu2+形成的配合物比钙黄绿素-Cu2+配合物更稳定,氨基酸与钙黄绿素-Cu2+反应使钙黄绿素游离释放出荧光,能灵敏、间接的测定氨基酸含量.对酪氨酸检测的线性范围为10×10-3乙100×10-3g·L-1,相关系数r=0.9991.结果表明,该方法可用于测定蛋白酶的水解活性以及实时监测释放游离氨基酸的反应过程.     

用于高通量筛选蛋白酶的氨基酸间接荧光测定法

建立了一种用间接荧光分析快速测定氨基酸的新方法。Cu2+与钙黄绿素结合成钙黄绿素-Cu2+后发生荧光淬灭,氨基酸与Cu2+形成的配合物比钙黄绿素-Cu2+配合物更稳定,氨基酸与钙黄绿素-Cu2+反应使钙黄绿素游离释放出荧光,能灵敏、间接的测定氨基酸含量。对酪氨酸检测的线性范围为10×10-3¹00×10-3g·L-1,相关系数r=0.9991。结果表明,该方法可用于测定蛋白酶的水解活性以及实时监测释放游离氨基酸的反应过程。      

酵母细胞破碎条件优化及高肽酶菌株筛选

为构建酵母细胞总肽酶活力的测定方法。采用单因素试验和L9(34)正交试验设计,以反应体系中游离氨基酸总量为肽酶活力指标,对酵母细胞破碎条件进行优化。结果表明：最佳破壁条件为：蜗牛酶添加量10mg/mL、超声破碎功率500W、超声时间8min、超声时间间隔5s。在此条件下,对主要源于贵州特色发酵豆制品的61 株酵母菌进行总肽酶活力测定,获得产高肽酶酵母菌4 株,即WCF-5、XWF-1、XWF-7 和YZJ-4。     

荧光探针在高通量筛选技术上的应用进展

荧光探针是一种分析检测工具,针对特定的化学物质可以将微观的识别信息转化为宏观的荧光信号,具有高灵敏度、高选择性、检测体系干扰小、操作简便等优点.基于荧光探针的优势,其在高通量筛选技术领域有着重要的应用.该文主要综述了荧光探针的起源、作用机理以及国内外关于荧光探针在高通量筛选技术上的应用进展,旨在为拓宽荧光探针技术的应用...     

CFTR特异性抑制剂CFTRinh-172的高通量筛选与研究进展

小分子特异性抑制剂CFTRinh-172是该领域科研试验的标准参照物。文章梳理归纳了多年来对CFTRinh-172的研究进展,从化学结构、作用机制和药代动力学,以及在霍乱、多囊肾病和白血病等恶性疾病的治疗研究和药物研发等方面,全面阐述了CFTRinh-172作为CFTR氯离子通道的特异性小分子抑制剂的重要意义,剖析其水溶性、安全性等潜在的问题。     

高通量筛选辣椒素与辣椒素酯生物活性的初步研究

目的:研究辣椒素及辣椒素酯类物质的生物活性.方法:采用高通量药物筛选方法,以过氧化物酶增殖激活受体(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor,PPARγ)模型及小鼠前脂肪细胞313-L1模型研究辣椒素及辣椒素酯类物质在糖脂代谢中的作用;通过乳腺癌细胞(MCF-7)和肝癌细胞(HepG2)研究它们对肿瘤细胞生长的影响.结果:辣椒素(capsaicine)及辣椒素类物质(辣椒素与二氢辣椒素混合物)在质量浓度10μg/mL时对PPARγ受体的相对激活倍数均大于2倍;酶促合成的辣椒素酯类物质(壬酸香草醇酯、癸酸香草醇酯、天然结构辣椒素酯类物质、菜油基香草醇酯类物质)4个样品的四氮唑盐酶还原法(MTS)试验毒性范围大于50μg/mL,它们的质量浓度为50μg/mL时对PPARγ受体的相对激活倍数分别达到10.7、9.2、9.9、1.5倍.当试验样品的质量浓度为10μg/mL时对小鼠前脂肪细胞3T3-L1的脂肪分化进程没有显著的抑制作用.当辣椒素类物质质量浓度为50μg/mL,酶法制备的天然结构辣椒素酯类物质(capsinoids)质量浓度为100μg/mL时,均对试验的乳腺癌细胞(MCF-7)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用.结论:辣椒素及辣椒素酯类物质具有PPARγ活性及显著的抑制乳腺癌细胞(MCF-7)和肝癌细胞(HepG2)活性.     

高通量筛选研究茯砖茶对FXR模型的作用

将茯砖茶水提液分别用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,制得三氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层样品,茶渣用95%的乙醇提取,制得乙醇提取物,通过高通量药物筛选测定各样品对法尼酯衍生物X受体(FXR)模型的激活和抑制作用,研究茯砖茶的降脂减肥功效,结果显示茯砖茶各部份对FXR都有抑制作用,乙酸乙酯层样品激活作用较明显,从中分离制得儿茶素EGCG及ECG单体对FXR模型有很好的激活作用,证明茯砖茶有较强的降脂功能,有望开发成天然的降脂药物。茯砖茶中其他活性成分的分离有待进一步进行。     

高生存性乳酸菌的筛选

对MRS培养基进行了厌氧培养,从内蒙古传统发酵乳制品中分离了80株菌,通过镜检、过氧化氢实验、发酵核糖、15℃和37℃发酵试验,获得了43株乳杆菌。结果表明,14株菌具有一定的耐酸和耐胆盐特性;其中2株鉴定为副干酪乳杆菌和植物乳杆菌,分别命名为Lactobacillus paracasei N1115和Lactobacillus plantarum N3114。