人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I（h-GnT-I）的原核表达与活性鉴定

-β--N-乙酰葡糖胺转移酶I（-h-GnT-I）功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个-β--1,2 连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的-h-GnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1?驻TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-IΔTM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱（HPLC）检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42 800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。     

酶法糖基化修饰对酪蛋白体外消化能力的影响

利用转谷氨酰胺酶（transglutaminase,TGase）催化制备壳寡糖（1 kDa）糖基化酪蛋白;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳和反相-高效液相色谱证实糖基化修饰反应的发生;体外消化实验（胃蛋白酶＋胰蛋白酶）分析糖基化修饰反应对酪蛋白消化性的影响。结果表明：TGase成功催化壳寡糖连接到酪蛋白分子上,所制备的糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖的导入量为6.86 g/kg;糖基化酪蛋白经体外模拟消化后,其水解度和三氯乙酸可溶性氮均低于酪蛋白对照物,糖基化酪蛋白消化物中出现了更多大分子质量的肽段,研究表明TGase途径糖基化修饰降低了酪蛋白的体外消化能力。     

重组黏质沙雷菌脂肪酶的可溶性表达及其性质研究

目的提高重组黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶（GST-lipase）可溶性表达量,研究其相关理化性质。方法PCR扩增lipase基因,与表达载体pGEX-4T-1连接后转入E.coli BL21（DE3）,优化培养提高可溶性表达量,表达产物用GST亲和层析柱纯化。研究温度、pH等对酶活性的影响,重组酶的底物特异性以及对（±）-MPGM的手性拆分。结果优化后可溶性酶的活性可达8 612.3 U/L,纯化9.8倍后比活性为3.3 U/mg。重组脂肪酶的最适反应温度为30℃,最适pH为9.0。温度低于30℃、pH 6.0-6.8的条件下比较稳定。Ca^2＋,Fe^2＋等金属离子和一些非离子表面活性剂能提高酶的活性。硝基苯月桂酸酯（C12）是其最适底物。以（±）-MPGM为底物,4 h后转化率达到47.3%,ee值为89.7%。结论优化后可溶性脂肪酶的活性大大提高,研究了重组脂肪酶的相关性质,为地尔硫的工业化生产奠定了基础。     

酪蛋白糖基化改性的研究进展

随着人们对食物的营养要求提高以及食品加工工业技术的发展，蛋白质的修饰加工已成为食品工业关注热点之一。相比于其它化学修饰，糖基化修饰产物的安全性更高，在改善食品感官特性方面应用潜力巨大。本文综述了酪蛋白糖基化反应的研究进展，包括共价连接糖基化反应和非共价连接糖基化反应，以及糖基化反应对酪蛋白功能特性的影响，综合分析影响酪蛋白糖基化改性的糖基化方法和糖基种类。糖基化改性是一种具有广阔应用前景及社会意义的蛋白质改性手段，可以从多个方面提高酪蛋白的功能特性，以期为乳制品加工产业乃至食品开发研究提供一定的帮助。     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

抗甲硝唑单链抗体融合蛋白的表达及其ELISA检测方法建立

为实现甲硝唑单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)在大肠杆菌中的可溶性表达,以甲硝唑抗体可变区基因(VH、VL)为模板,扩增甲硝唑的scFv基因,scFv双酶切后与PLIP6/GN载体重组,构建重组质粒PLIP6/GNscFv,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆转大肠杆菌BL21经温度诱导表达重组单链抗体,并通过聚丙酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对其鉴定。采用竞争酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明诱导表达的scFv分子量接近33 kDa,能够特异性识别兽药甲硝唑,半抑制率(IC50)为(0.72±0.04)ng/mL。选择虾样品进行添加回收试验,建立的方法检测其回收率在88.54%到113.27%之间。这说明成功构建重组质粒PLIP6/GN-scFv并实现可溶性表达并可用于实际样品检测。     

带有突变穿膜肽重组凋亡素可溶性表达的研究

目的构建apoptin（凋亡素）-HBDCK-pET28a突变体重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高效可溶性表达,并观察突变后穿膜肽（CPP）在HeLa细胞中的转导活性。方法采用PCR介导突变方法将重组蛋白apoptin-HBD及EGFP-HBD的HBD结构域中的Cys（C）突变为Lys（K）。突变的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,Ni2＋-NTA亲和层析纯化目的蛋白,进一步观察HeLa细胞突变后HBD的转导活性。结果经双酶切鉴定和序列分析,突变后的重组质粒apoptin-HBDCK-pET28a及EGFP-HBDCK-pET28a构建正确。转化E.coli BL21（DE3）后,融合蛋白均获得可溶性表达。EGFP-HBDCK作用于HeLa细胞13 h后,可观察到细胞内强绿色荧光。结论 HBD结构域中C突变为K,可达到融合蛋白可溶性表达的目的,且仍能保持很强的转导活性,可携带EGFP蛋白进入HeLa细胞。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶（catalase,CAT）。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx．HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

糖基化肽的制备、结构表征及生物活性研究进展

肽的结构和功能易受温度、pH值和离子强度改变等环境因素的影响，而糖基团可与肽的氨基酸侧链基团形成共价键进而发生结构修饰，糖基化修饰能有效提高肽分子的稳定性和生物活性。文章综述了糖基化肽的制备方法与结构表征策略，重点阐述了糖基化肽生理活性影响的最新研究进展；并分析了糖基化修饰肽所面临的挑战及未来研究方向。