毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

从碳源、生物素、接种比率、甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对重组酵母摇瓶发酵条件进行了研究,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,发现控制适宜的甲醇浓度十分重要。同时,利用30L发酵罐对长时间甲醇诱导发酵做了研究,发现随着发酵时间的增加,分泌蛋白产量先增加然后下降,菌体生长速度放慢,但菌体湿重一直在增加。      

牛肉风味强化肽表达条件的初步研究

牛肉风味强化肽(BeefyMeatyPeptide,BMP)最初是从牛肉的消化液中分离的八肽,能增强鲜味,可作为一种类似于谷氨酸钠的天然风味强化剂。文章介绍了利用基因工程技术在酵母菌中表达BMP的方法,对构建的Pichiapastoris酵母工程菌株X-33/pPICZαA-BMP进行了发酵表达,确定了菌株的表型、高密度生长及表达条件。试验结果显示:构建的工程菌株为甲醇利用慢表型Muts,优化后的种子培养基摇瓶条件下菌体密度OD600达到28。在pH3.0、诱导72h、甲醇添加量为0.5%的条件下BMP有最大表达,选用BSM有利于诱导表达BMP;建立了SephadexG-25分离纯化、RP-HPLC检测BMP的有效方法。     

利用GAP启动子在毕赤酵母中表达牛肉风味强化肽

牛肉风味强化肽是1种从牛肉木瓜蛋白酶的水解物中分离得到的风味强化八肽。为了提供能够大量且廉价得到这种小肽物质的表达基因,本实验室工作人员构建以甲醇为诱导物并带有16拷贝BMP基因的表达载体pPIC9-16BMP。本文为了提高食品的安全性,避免甲醇作为诱导物,探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白的可能性。应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9-16BMP上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9-16BMP。转化毕赤酵母GS115,对获得的高拷贝转化子毕赤酵母GS115(pGAP9-16BMP)进行组成型表达,并用SDS-PAGE检测到目的产物。     

表达牛肉风味肽的重组毕赤酵母部分生物学特性的研究

对分泌表达16拷贝牛肉风味肽毕赤酵母工程菌株)的生物表型、生长特性、表达特性及遗传稳定性等进行了研究.结果表明:该重组菌株的表型为Mut+:在5L发酵罐中,采用BSM培养基,设定适合的菌体培养温度和pH值,通过调节搅拌速度、通气量和罐压等措施使溶氧(DO)维持在20%～35%,当诱导90h后(发酵110h),目的产物BMP的表达量达到最高为54 mg/L,是其摇瓶水平的5.4倍;遗传稳定性分析实验及PCR检测结果证明,重组菌株具有良好的遗传稳定性和重组蛋白表达的稳定性.     

毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

从碳源、生物素、接种比率、甲醇浓度、pH、诱导时间等方面时重组酵母摇瓶发酵务件进行了研究,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,发现控制适宜的甲醇浓度十分重要.同时,利用30L发酵罐对长时间甲醇诱导发酵做了研究.发现随着发酵时间的增加,分泌蛋白产量先增加然后下降,菌体生长速度放慢,但菌体湿重一直在增加.     

毕赤酵母产类人胶原蛋白发酵条件的优化

胶原蛋白是结缔组织中一种重要蛋白质,具有抗皱、抗老化和补钙壮骨的功效,在食品工业中应用广泛.由于胶原蛋白的需求量大,因此利用重组微生物生产胶原蛋白成为近年来的研究热点.该文采用重组有类人胶原蛋白基因的毕赤酵母,通过优化培养基成分,使其在无机盐培养基中表达胶原蛋白.首先,类人胶原蛋白在每24 h补加体积分数1.5％甲醇诱...     

毕赤酵母发酵生产甲醇蛋白工艺条件的优化

利用实验室选育驯化出的高产甲醇蛋白的毕赤酵母(Pichia pastorisYM-SCP02)作为甲醇蛋白生产菌种,对甲醇蛋白发酵生产过程中的关键因素进行较为全面的考察和优化,初步确定了摇瓶水平发酵各因素的最优条件为接种量8%,分段发酵温度采用0~36 h,30℃,36~64 h,28℃,初始pH值为5.0,初始甲醇添加量为1.2%,装液量为50 mL/250 mL摇瓶,转速为200 r/min。在此条件下,得到的甲醇蛋白最高产量(细胞干质量)为19.3g/L。     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A（Mut⁺）和KM71/Xyn43A（Mut^s）。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。      

毕赤酵母高效表达重组β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导方法研究

将甘草酸生物转化合成GAMG已成为国内外医药和食品行业研究的热点。该文在前期构建毕赤酵母(pichia pastoris)工程菌GS115-GUS的基础上,对重组毕赤酵母工程菌发酵条件进行了研究。通过单因素及正交试验建立工程菌最佳表达β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导产酶方法:重组毕赤酵母GS115-GUS菌株在液体YPD培养基中活化24 h后,接种到BMGY中富集菌体,OD600达到6.0时,按照1∶1(V/V)的接种比率接入到pH为6.0的BMMY培养基中,加入1.5%诱导剂甲醇诱导产酶,且每隔24 h添加一次。该诱导产酶条件简单、易行、科学、合理,毕赤酵母高效表达GAMG的酶活高达1.97×103 U/mL,研究结果达到预期目标,为进一步研究重组酵母工程菌产β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵水平、β-葡萄糖醛酸苷酶生物催化甘草酸制备GAMG以及工业化生产奠定基础。     

植酸酶毕赤酵母基因工程菌发酵条件的优化

对植酸酶毕赤酵母基因工程菌的营养条件和发酵条件进行研究.结果表明,其最佳培养基配方为(g/100 mL):葡萄糖5.00,玉米浆3.00,KCl 0.05,MnSO4·7H2O 0.03,FeSO4·7H2O 0.03,MgSO4·7H2O 0.07,KH2PO4 0.02;其最佳培养条件为:发酵初始pH 6.0,发酵温度31℃,用250 mL三角瓶,装液量为40 mL,菌体的接种量为10%(v:v),发酵周期60 h.在最佳发酵条件下,植酸酶活力提高3.57倍,高达5 462 u/mL.     

Safe preparation of beefy meaty peptide with Bacillus subtilis

Preparation of flavour peptides with microorganisms is an attractive choice for its large-scale production. However, beefy meaty peptide (BMP), as a research hotspot in the field of umami peptide, has been studied in few microorganisms, and furthermore, the safe preparation of BMP has not yet been reported. In this study, multi-copy BMP (8BMP) was successfully expressed and produced in the ‘generally recognized as safe’ Bacillus subtilis (B. subtilis). Firstly, 8BMP with the potentially intense umami was screened out based on molecular docking analysis. Then, it was successfully expressed in the B. subtilis 168 and verified through sensory evaluation. Finally, the scaling capacity of 8BMP was evaluated in a 5-L fermenter, with the highest yield (0.84 g L⁻¹) 6.4 times than that of shake flask, which is conductive for industrial production of BMP and other food peptides.     

重组毕赤酵母菌发酵木薯脱氰工艺的优化

木薯块根和皮中都含有有毒物质氢氰酸,在食品和饲料行业进行木薯产品加工之前都要进行脱毒处理,传统的浸水、晒干、烘干和水煮等方法在脱毒效率、成本以及溶剂残留等方面显得不尽人意,这就使得木薯在食品和饲料行业的广泛应用大受限制,因此寻找一种高效安全的脱毒方法应用在木薯产品的加工中显得非常有意义。本实验以重组毕赤酵母 GS115-Ch-Glu为实验对象,以 HCN 脱除率为主要指标,考察了接种量、温度、pH 值、水分、发酵时间等因素对毕赤酵母发酵木薯脱氰的影响,在单因素实验基础上对木薯发酵脱毒进行正交试验,最后确定了最佳发酵脱毒工艺条件为：接种量2.0%、温度30℃、pH6.0、水分50%及发酵时间54 h。在此最佳条件下,HCN脱除率达95.0%以上,是目前已知微生物法木薯脱毒的最高 HCN脱除率。     

重组毕赤酵母产果糖基转移酶发酵条件的优化

果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导温度为30℃、初始甲醇浓度为1.0%、后续甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度10 g/L、诱导时间为120 h。在优化的发酵产酶条件下,重组果糖基转移酶酶活力达218.3 U/m L,较优化前提高了5倍。     

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。      

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。     

产柚苷酶黑曲霉SL2K发酵条件优化

该研究以黑曲霉（Aspergillus niger）SL2K为研究对象,对其产柚苷酶的液态发酵条件进行优化。 通过单因素试验对碳源、氮 源、诱导物、接种量、初始pH值和培养时间进行考查,在单因素基础上,选取麸皮粉添加量、蛋白胨添加量、接种量、初始pH值4个因素 进行4水平正交试验优化。 结果表明,优化后的产酶发酵条件为麸皮粉添加量3%,蛋白胨添加量5%,接种量8%,初始pH值为5.0,鼠李 糖0.08%、KH2PO4 1 g/L,KCl 0.5 g/L,MgSO·4 7H2O 0.5 g/L,FeSO4 0.01 g/L,装液量为100 mL/250 mL,摇床转速180 r/min,培养温度28 ℃, 培养时间96 h。 在此优化条件下,柚苷酶活力为233.89 U/mL,是优化前的2.13倍。     

谷胱甘肽生产菌重组巴斯德毕赤氏酵母的构建

目的：构建一株新型的产谷胱甘肽的重组巴斯德毕赤氏酵母，并研究该重组菌合成谷胱甘肽的能力；方法：利用PCR技术克隆来源于酿酒酵母的1-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶编码基因GSHI和谷胱甘肽合成酶的基因GSH2，串联插入表达载体pGAPZA，转化Pichia pastoris GS115，在Zeocin平板上挑选阳性转化子，并对阳性转化重组菌进行摇瓶培养筛选。结果：得到一株GSH的产量高达162．2mg／L重组菌，说明串联表达酿酒酵母GSH1和GSH2基因，重组甲醇酵母生产谷胱甘肽可以达到较高的水平。     

阿尼芬净合成前体棘白菌素B发酵条件优化

阿尼芬净为新一代棘白菌素类抗生素,其前体物质棘白菌素B(ECB)发酵单位的高低将直接影响阿尼芬净的市场前景.利用构巢曲霉发酵合成ECB,采用单因素实验考察不同参数对ECB产量的影响.结果显示:低温培养有利于ECB的合成,选择前3天37℃培养,后9天25℃培养,ECB产量可达1 237 mg/L,比25℃恒温培养提高了69.9％;最佳的初始pH为6.5;添加0.6 g/LZnCl2可使ECB产量达到1 100 mg/L,比初始发酵培养基提高了69.2％;前体物质脯氨酸及鸟氨酸的添加可以显著提高ECB产量,在第6天添加2 g/L脯氨酸或在第3天添加2 g/L鸟氨酸可使ECB产量分别提高57.4％和55.2％.