抗黄曲霉毒素B1独特型纳米抗体的表达及复性

目的快速制备大量具有生物活性的独特型纳米抗体F7。方法构建pET22b-F7原核表达载体,转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,对诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间进行优化。结果独特型纳米抗体F7表达量有所增加但主要以包涵体形式存在。经过包涵体的溶解、复性获得了具有生物活性的抗AFB1独特型纳米抗体,ELISA证实复性后的蛋白依然存在对鼠源AFB1抗体的结合特性。结论为后续抗体的性质研究和改造奠定了基础。     

抗黄曲霉毒素B_1纳米抗体的原核表达、纯化及活性分析

表达和纯化抗黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)纳米抗体(G8),并分析纳米抗体的热稳定性及生物学活性,建立基于纳米抗体检测AFB1的ELISA方法。将编码抗AFB1纳米抗体的基因亚克隆至原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21(Rosetta,DE3),IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析蛋白表达情况;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析纳米抗体的热稳定性、有机溶剂耐受性、盐离子耐受性及耐酸碱性。结果显示,在大肠杆菌中成功表达可溶性的抗AFB1纳米抗体,表达量为80 mg/L,在25~65℃之间,抗体具有良好的热稳定性。在5%甲醇、p H7.4、10 mmol/L PBS条件下,建立了G8-ELISA检测AFB1的方法,该方法的半抑制浓度(IC50)为4.61 ng/m L,线性范围为0.95~42.45 ng/m L。     

抗黄曲霉毒素B_1单抗独特型抗体的制备

目的研制黄曲霉毒素B1标准品的替代品并应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)。方法在研制了抗黄曲霉毒素B1单抗的基础上,将抗体用无花果蛋白酶进行酶切,制备出抗黄曲霉毒素B1单抗F(ab’)2片段,并以F(ab’)2片段作为免疫原免疫日本大耳白兔,制备出抗黄曲霉毒素B1单抗独特型抗体,并对该独特型抗体进行鉴定。结果该独特型抗体是Ab2β型,与黄曲霉毒素B1存在内影像关系。结论该抗体可以替代黄曲霉毒素B1标准品应用于ELISA检测。     

抗黄曲霉毒素B1单链抗体的表达载体的比较

目的：比较4 种不同的pET 载体在表达抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的单链抗体(scFv)克隆的特点,确定用以表达scFv-H4 的合适载体。方法：将目的基因H4 分别克隆到载体pET20b、pET22b、pET28a 和pET32a 上,分别转入大肠杆菌BL21(DE3)或Origami(DE3)中,比较诱导过程中细胞的生长状况和诱导结束后细胞破碎液中scFv-H4的生物活性以及细胞各部分包涵体。结果：pET20b 和pET22b 能表达具有生物活性的scFv-H4,这些具有生物活性的蛋白主要存在于周质中;pET28a 和pET32a 不能表达有生物活性的scFv-H4,而pET32a 仅能在细胞质中产生大量的包涵体。结论：pET22b 可能是表达AFB1 的单链抗体较优的表达载体。     

基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析（BLEIA）方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体（NB）与纳米荧光素酶（Nluc）融合蛋白（G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28）的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC50值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-...     

抗赭曲霉毒素A五价纳米抗体的表达及分析

利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体pET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,SDS-PAGE凝胶电泳分析融合蛋白表达情况。结果显示CTB-VHH28为可溶表达,其中单体分子量大小约30 kDa,五聚体分子量大小约150 kDa,均与预测的分子量大小一致;确定了其最优表达条件为:IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为16℃,诱导时间为10 h。经过镍柱纯化后成功得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量为20 mg/L。对其活性进行测定,结果表明CTB-VHH28能与赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)特异性结合,在2.5%甲醇条件下,间接竞争ELISA半抑制浓度(IC₅₀)为0.38 ng/mL。热稳定性及甲醇耐受性结果显示,CTB-VHH28在25~55℃具有良好的热稳定性,反应体系中甲醇浓度低于20%时,竞争抑制率变化不大,具有较好的甲醇耐受性。结论:本研究所制备的五价纳米抗体可以用于OTA检测。     

粮油中黄曲霉毒素B1的监测

利用简单的仪器设备监测粮油中的黄曲霉毒素B1，此法直接、快速，利于推广普及。     

纳米金标记黄曲霉毒素B1新型检测方法

本文建立了两种基于银增强纳米金标记探针的高灵敏度免疫分析方法.方法一是用黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体与金标抗原、待测抗原进行竞争免疫反应,然后加入银增强溶液,以金为核沉积生长银,通过检测光密度来确定待测物中AFB1的含量,该方法的检出限可达到0.01 ng/mL.方法二是在前一种方法的基础上,将银化学溶出,通过化学发光法检测沉积的银量来确定待测物中AFB1的含量,该方法的检出限可达到0.002 ng/mL.     

黄曲霉毒素B1检测方法的分析

黄曲霉毒素B1是一种致癌物质 ,许多国家已将其限量标准提高 ,黄曲霉毒素B1检测方法的检出限已因其毒性而提高 ,并已成为国际贸易中新的技术壁垒。文中介绍了黄曲霉毒素B1的几种常见检测方法 ,并对其特点及检出限进行了概括性的分析。     

应用抗黄曲霉毒素单链抗体检测酱油中黄曲霉毒素B1

利用本实验室制备的抗黄曲霉毒素B1的单链抗体(ScFv),通过棋盘实验确定了抗原抗体的最适工作浓度,在此之上根据间接竞争酶联免疫法(ELISA)绘制标准曲线,检测酱油中AFB1的含量;通过改变样品的盐浓度及pH来确定其对ELISA检测结果的影响。研究结果表明,利用ScFv检测黄曲霉毒素的最小检测值为0.10ng/mL,平均加标回收率在84%～109%之间,本文建立的ELISA方法在pH5～8,盐浓度小于10%时较稳定。本文建立的利用抗AFB1的ScFv检测黄曲霉毒素含量的方法方便快捷,稳定性较好,并且成本较低,适合于食品中黄曲霉毒素的检测。     

抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体细胞株的筛选

研究筛选到抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体细胞株,用AFM1-oxim e-BSA偶联物免疫Balb/C小鼠后,取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经过3次克隆和亚克隆得到两株稳定分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的杂交瘤细胞株,经过检测两株均为IgG1亚类,并且经过鉴定其各项性质均符合标准。     

抗伏马菌素B_1单链抗体的原核表达及其抗体活性和稳定性分析

研究了对抗伏马菌素B1单链抗体在不同原核表达条件下表达情况及其抗体稳定性,以促进其在免疫学分析中的应用。通过构建表达载体pET22b-1D11和pMAL-1D11,分析了诱导温度、诱导剂浓度、宿主菌和高溶解性标签蛋白对单链抗体表达形式的影响;采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)分析了单链抗体的热稳定性和有机溶剂耐受性。结果表明:条件优化后,单链抗体及其融合蛋白主要以包涵体形式表达;热处理会降低单链抗体活性甚至使其完全失活,甲醇会降低基于单链抗体的ELISA体系的灵敏度。     

高效液相色谱法测定粮谷中黄曲霉毒素B1的研究

建立了用三氯甲烷提取、硅胶小柱净化、三氟乙酸衍生,再以荧光检测器来测定粮谷中黄曲霉毒素B1的高效液相色谱方法.试验证明,该方法安全限量标准最低可达0.4 μg/kg,线性在2～50 μg/kg良好,平均回收率较高,具有准确度高、精密度好、安全限量低的特点.     

黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选及鉴定

该研究以香豆素为唯一碳源,从豆类发酵食品、土壤、动物肠道及其内容物中筛选黄曲霉毒素B1（AFB1）降解菌株;然后通过复筛,从中筛选出AFB1降解能力较好的菌株,并对其降解作用与吸附作用进行区分;最后,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定。结果表明,共筛选得到9株AFB1降解菌株,其中菌株YC2的AFB1降解能力最强,AFB1降解率达到90.7%,并确定菌株YC2通过降解作用去除AFB1。最后,菌株YC2被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。     

黄曲霉毒素B_1降解菌株的筛选鉴定

黄曲霉毒素B_1(AFB_1)具有极强的毒性和致癌性,严重危害人和动物健康。通过富集培养、初筛和复筛从土壤中筛选到能降解黄曲霉毒素的菌株,鉴定降解效率最高菌株并研究其降解特征。结果表明,筛选出多株能降解AFB_1菌株,其中菌株A12降解效率最高,通过形态学、生理生化特征及16S rRNA基因系统进化分析鉴定菌株A12为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis subsp. InaquosorumA12。研究发现枯草芽孢杆菌A12上清液、菌悬液、胞内液能分别降解87.6%、17.3%和10.8%的AFB_1,表明菌株A12分泌至胞外活性物质主导生物降解作用。菌株A12上清液降解AFB_1的最适反应温度为37℃,最适p H为7.0。将该菌接种到AFB_1污染的花生样品,能显著降低AFB_1的含量。为枯草芽孢杆菌A12应用于AFB_1的生物脱毒奠定了基础。     

生物技术对黄曲霉毒素B1的脱除及机制研究进展

黄曲霉毒素是危害最大的真菌毒素之一,而黄曲霉毒素B₁(AFB₁)是黄曲霉毒素中毒性最大的一种,具有高毒性、致癌、致畸和致突变的作用,对动物和人类健康造成危害。为了有效脱除AFB₁,综述了近年来研究的具有解毒作用的微生物,介绍了采用生物技术脱除AFB₁的方法,重点探讨了生物脱除AFB₁机制。用于脱除AFB₁的菌株有芽孢杆菌、假单胞菌、乳酸菌、非产毒曲霉等,可采用单菌种发酵、多菌种协同发酵和菌-酶协同作用脱除AFB₁。生物脱除AFB₁机制主要为降解脱除和吸附脱除。可进一步筛选具有高优良能力的菌株以及更深层次地研究微生物脱毒的机制,探索微生物制剂对AFB₁的降解作用。     

细菌降解黄曲霉毒素B1的研究进展

黄曲霉毒素B1是目前已发现的黄曲霉毒素中毒性最强的一种,其具有强肝毒性、高致突变性和高致畸性。广泛存在于农产品及饲料食品中,对人类健康存在严重威胁,同时对粮食和畜牧业造成严重的经济损失。细菌降解黄曲霉毒素B1是一种有效、安全和环保的解毒方法,该文通过对黄曲霉毒素B1降解的影响因素、细菌胞外酶和胞内酶等对黄曲霉毒素B1的降解机理以及黄曲霉毒素B1降解菌活性产物的应用研究等方面对细菌降解黄曲霉毒素B1进行了论述,并对细菌降解黄曲霉毒素B1应用前景进行展望,为以后更进一步研究提供较为全面的资料。     

基于金标抗体的电化学免疫传感器检测米糠油中黄曲霉毒素B1

目的 为了快速检测食品中黄曲霉毒素B1的含量,本文提出一种以胶体金标记抗体的电化学免疫传感器用于米糠油中AFB1的检测。方法 首先在金电极(AuE)表面修饰抗原,再进一步修饰制备好的金标抗体,最后带有辣根过氧化物酶的二抗(IgG-HRP)通过与抗体反应结合到电极表面。当目标物AFB1存在时,与抗原竞争结合金标抗体,HRP催化过氧化氢(H2O2>)将溶液中对苯二酚(HQ)氧化成苯醌(BQ)的电流信号会下降,间接检测AFB1。结果 该免疫传感器在抗原包被量和金标抗体用量为3 μL且金标抗体与AFB1孵育80 min条件下具有最佳性能。该法线性范围为0.02 ng/mL~80 ng/mL,检出限为0.027 ng/mL。将该传感器应用于米糠油中进行加标回收实验,回收率在88.7%～108.0%。结论 该传感器具有良好的特异性、重现性和稳定性,可用于植物油中AFB1的快速检测。