呼吸道合胞病毒截短G蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

目的构建呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)截短G蛋白的原核表达载体,并对表达、纯化后的蛋白进行免疫原性及相关免疫指标的检测。方法人工合成G蛋白基因的部分核酸序列,采用重叠PCR法将CX3C模序替换为RSV M蛋白上的CTL表位,构建原核表达载体GCX3C-pET22b和GCTL-pET22b,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,免疫昆明小鼠,实验分GCX3C组(100μg GCX3C)、GCTL组(100μg GCTL)、阴性对照组(100μlPBS),分别于0、1、4周经小鼠双后侧肌肉注射免疫,经尾梢静脉取血,分离血清,检测IgG水平及嗜酸性粒细胞的数量,并通过小鼠体外淋巴细胞杀伤试验鉴定RSV特异性CTL应答。结果重组原核表达载体经双酶切及测序鉴定,证明G蛋白基因改造成功;重组蛋白的相对分子质量约14 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RSV血清发生特异性反应;小鼠血清中的特异性IgG水平随免疫次数的增加而升高(P<0.01),GCX3C蛋白和GCTL蛋白的几何平均滴度分别为1 584.89和1 995.26;GCX3C组较GCTL组小鼠血清中嗜酸性粒细胞数量明显增加(P<0.01);GCTL蛋白免疫小鼠后可产生RSV特异性的CTL应答效应。结论已成功原核表达了GCX3C蛋白和GCTL蛋白,两种蛋白均有较好的免疫原性,GCTL蛋白可消除由CX3C模序引起的嗜酸性粒细胞增多,并增强了CTL效应,G蛋白基因的改造达到了预期效果。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

呼吸道合胞病毒G蛋白研究进展

呼吸道合胞病毒G蛋白是该病毒的黏附蛋白,亚型间抗原结构高度变异,在病毒感染和诱导保护性免疫方面起到重要作用。本文对呼吸道合胞病毒G蛋白的结构、功能、免疫表位、CX3C模序及疫苗研制等作一综述。     

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白。方法从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4(N/X)和TB10.4(N/B)基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4(N/B)/pET-30a;从F/18T/DH5α菌株中扩增F1(B/X)基因,与TB10.4(N/B)/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13 000和59 000,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础。     

武汉地区呼吸道合胞病毒分离株的G蛋白基因遗传特征

目的分析武汉地区人呼吸道合胞病毒(RSV)分离株的G蛋白基因的遗传特征。方法使用不同的特异性引物,对武汉地区2006年分离的9株RSV进行G基因3′末端第2个高变区的序列测定,并进行基因分型和基因亲缘关系分析。结果分离的9株RSV中,33.3%(3/9)为A亚型,属GA2基因型;66.7%(6/9)为B亚型,其中1株属于BA基因型,5株属于GB8基因型。9株RSVG蛋白与原型株核苷酸同源性为84.5%～99.0%,且与原型株相比,在205～230位氨基酸中有5～8个位点氨基酸变异,还存在糖基化位点的改变。结论2006年初在武汉地区存在着由不同RSV株引起的传播链,A、B亚型共循环,B亚型是优势流行亚型;9株RSVG蛋白与原型比较,存在明显的差异。     

呼吸道合胞病毒蛋白的研究进展

本文对呼吸道合胞病毒基因组编码的病毒蛋白,包括膜蛋白、核蛋白、融合蛋白、基质蛋白及非结构蛋白的结构和功能的研究进展进行比较全面的综述。     

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。     

GST-AEP融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达GST-AEP融合蛋白,并进行纯化及鉴定。方法IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1/AEP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,溶菌酶裂解后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果大肠杆菌经诱导,高效表达出相对分子质量约34000的蛋白,与GST-AEP融合蛋白相符。Western blot结果显示该蛋白能够被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功表达并纯化了融合蛋白,为更深入研究AEP的结构和功能奠定了基础。     

SARS病毒刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得SARS病毒表面刺突蛋白片段。方法用PCR方法克隆SARSS2片段基因,并在大肠杆菌中进行表达。表达产物经SDSPAGE及Westernblot鉴定,阴离子交换层析纯化。结果SARS病毒S2片段基因在大肠杆菌中获得了高表达,表达量占总蛋白的50%以上;得到纯度大于90%的SARS蛋白样品。结论获得了能够应用于SARS疫苗研究的SARS蛋白样品。     

PTD-SARA融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的在大肠杆菌中表达PTD-SARA融合蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法使用大肠杆菌偏爱密码子合成PTD-SARA全长基因,将其克隆入载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-PTD-SARA,转化感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定及N-端测序。结果重组表达质粒pQE-30-PTD-SARA经双酶切及测序鉴定证明构建正确。1.0mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的25%,主要以包涵体形式存在。纯化的融合蛋白纯度为94%,浓度为0.2mg/ml,且具有良好的反应原性,N-端有14个氨基酸。结论已成功表达并纯化了PTD-SARA融合蛋白,为其功能的研究奠定了基础,也为临床防治肾脏纤维化提供了一个新的策略。     

人层粘连蛋白α4链LG1组件融合蛋白的表达

目的表达重组人层粘连蛋白α4链LG1组件(HumanLamininAlpha4LG1Module,hLNα4LG1)蛋白并检测其抗原性。方法采用RTPCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG1的cDNA片段,用TA克隆法将其插入pMD18T载体进行测序。用DNA重组技术构建原核表达载体pET28aLG1,用BL21(DE3)pET系统表达hLNα4LG1融合蛋白,SDSPAGE鉴定表达产物,用NiNTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,并进行Westernblot分析。结果已成功获得hLNα4LG1cDNA序列,与GenBank中序列同源性为100%。12%SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)pET28aLG1总蛋白中出现一条相对分子质量为26000的新蛋白带,纯化后目的蛋白纯度达90%以上,且Westernblot可特异地检测到目的蛋白所对应转移带。结论成功表达和纯化hLNα4LG1蛋白,且具有良好的抗原性,为研究LG组件在疾病发生过程中的作用及其功能位点打下了基础。     

SARS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中高效表达SARS核衣壳蛋白。方法将已合成的SARS-CoV N蛋白基因片段,克隆至pUC-18载体,与pET28质粒连接,转化大肠杆菌,进行SARS-CoV核衣壳融合蛋白表达。用SARS患者恢复期血清进行表达产物鉴定。用色谱方法进行表达产物的层析纯化。结果SARS病毒N基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的30%以上;经三步纯化后纯度达90%以上。结论已获得了SARS核衣壳蛋白样品。     

狂犬病病毒糖蛋白富集表位基因克隆及其在原核系统中的表达

目的构建狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统。方法通过RT-PCR扩增CVS-24株糖蛋白两段表位富集区基因,并将其克隆至载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-G1和pET-G2,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物分别经12%SDS-PAGE和Western blot检测。结果大肠杆菌可高效表达目的基因,所表达的蛋白可被狂犬病病毒标准阳性血清所识别。经薄层扫描分析,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42%(G1)和34%(G2)。结论已成功构建了狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统,所表达的目的蛋白具有良好的免疫反应性,有可能作为检测狂犬病病毒血清抗体的候选基因。     

人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化

目的表达并纯化人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白。方法用RT-PCR法从人甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)中扩增NS1基因,克隆入原核表达载体pTXB1,构建重组原核表达质粒pTXB1/NS1,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达形式和表达量。经几丁质柱亲和层析纯化表达蛋白,串联飞行时间质谱仪检测其相对分子质量。结果所构建的重组表达质粒pTXB1/NS1序列完整,插入的基因片段全长690bp。以1.0mmol/LIPTG37℃诱导4h,重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的50%以上。破菌上清及沉淀中均有目的蛋白表达。纯化的NS1蛋白纯度达95%以上,相对分子质量约为26000。结论已成功表达并纯化了人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白,为其进一步的研究奠定了基础。