人肝癌细胞Hep-G2的冷冻干燥保存初探

冷冻干燥是长期有效保存细胞的手段之一。本文以肝癌细胞Hep-G2为研究对象,选取了不同体积分数的Me2SO、丙三醇及不同质量浓度的PVP、复方保护剂进行冷冻干燥保存,筛选出最佳保护剂配方。此外,将细胞在不同摩尔浓度的海藻糖溶液中孵育,通过检测细胞回收率、存活率和24 h贴壁率,探究胞内海藻糖对细胞冷冻干燥的影响。结果表明:添加40%PVP(w/v)+10%甘油(v/v)+15%FBS(v/v)+20%海藻糖(w/v)保护剂的细胞,在复水后回收率、存活率和24 h贴壁率分别为29.58%、42.18%和18.71%,与对照组相比三项指标均得到有效提高,该种保护剂的效果最佳;当胞外海藻糖摩尔浓度为800 mmol/L时,冻干效果最好,肝癌细胞Hep-G2在复水后回收率、存活率和24 h贴壁率分别为27.81%,66.65%和33.68%,存活率和贴壁率显著高于其他组。     

低温保存对Hep-G2细胞凋亡的影响

样本质量是体现生物样本库价值的关键,但是低温保存可能导致细胞凋亡及基因表达量的变化,影响样本质量。本文采用流式细胞术与实时荧光定量PCR(qPCR)的方法,研究了Hep-G2细胞在不同条件下冻存后凋亡及相关基因表达量。结果表明:低温保存影响Hep-G2细胞的成活率、凋亡情况及某些凋亡基因表达量。无论冻存过程中是否添加低温保护剂,低温保存都会对细胞的凋亡相关基因表达带来不同程度的影响。不添加保护剂冻存会导致细胞死亡,添加10%DMSO冻存会导致细胞凋亡,复苏培养24 h后细胞的成活率、凋亡情况与相关基因表达量基本与对照组水平一致。     

肺癌细胞微团的低温保存实验

细胞微团、细胞聚集体所构建的三维细胞模型在肿瘤研究领域中逐渐成为更合适的体外研究模型,但目前对于细胞微团的低温保存方法尚不完善.本文研究了A549肺癌细胞的接种密度以及培养天数对肺癌细胞微团尺寸及生长状态的影响,结果表明:接种密度为2×104个/mL,培养三天的肺癌细胞微团状态良好,可形成致密的结构,微团直径为344....     

人体细胞的低温保存与冷冻干燥

本文阐述了细胞和组织的低温保存和冷冻干燥的意义、现状、以及所研究的技术科学问题.包括低温损伤与溶液冻结相变的传热传质过程的关系;降温和复温过程的热分析和热控制;低温保存的玻璃化理论;水溶液的非晶态化特性的研究;一些新的技术手段和仪器设备;组织工程化细胞和组织的低温保存;活细胞的冷冻干燥.     

复杂组织器官低温保存研究进展

近年来,器官移植术以及相关基础研究的快速发展对复杂组织器官的高质量保存提出了迫切需求。供体组织器官的缺乏以及供体和受体在时间和空间上的不匹配限制了其在临床上的应用,低温保存有望解决这一限制。目前,虽然已经成功实现了细胞、胚胎等小尺寸生物样本的低温保存,但对大体积的复杂组织器官来讲,现有低温保存技术仍然面临诸多瓶颈问题。特别是真空及纳米等工程学技术的应用及对低温保存过程中损伤因素的认识不断深入,拓展了传统低温保存的研究范畴,有望突破当前复杂组织器官低温保存中的技术瓶颈。本文综述了复杂组织器官低温保存的常用方法及损伤因素,阐述了真空及纳米技术在调控冰晶成长、实现均匀快速复温等方面的应用。同时,介绍了先进生物材料改善低温保存效果的机制及其在低温保存中的应用,并对该领域未来发展趋势提出了建议。     

培养9天的组织工程化真皮低温保存的研究

组织工程化真皮的低温保存是皮肤组织工程的重要组成部分，对皮肤组织库的建立有重要意义。以培养一定时间的组织工程化真皮为试材，以四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率，辅以光学显微镜和扫描电镜观察分析，试验研究了低温保护剂预处理方式、降温程序及降温速率等条件对组织工程化真皮低温保存效果的影响。实验表明：将组织工程化真皮置于2．1mol/L的DMSO溶液中，在4℃下处理15min，再只将组织工程化真皮转入低温保存袋中，迅速热封口，以1℃／min速率降温又无恒温处理可获得较高的细胞存活率(72．8％～78％)，可满足临床应用的要求。     

基于蚕丝蛋白的低温保护剂用于梅山猪耳成纤维细胞的低温保存研究

细胞低温保存为临床治疗和科学研究提供优质的细胞。体积分数为10%二甲基亚砜(DMSO)和体积分数为20%胎牛血清(FBS)是目前冻存细胞常用的保护剂。但DMSO对细胞具有毒性损伤,FBS存在携带病毒、感染疾病的风险。本文以梅山猪耳成纤维细胞作为模型细胞进行冻存实验,将蚕丝蛋白用于低温保护剂中,用不同质量浓度的丝胶蛋白和不同体积分数的丝素蛋白来分别替代FBS和DMSO,验证其在细胞低温保存中的有效性。解冻复苏后用台盼蓝染色法、MTT法、24 h贴壁率等检测细胞的存活率和生长活力,筛选出最佳的基于天然蚕丝蛋白的低温保护剂配方。结果表明:含质量浓度为1%丝胶蛋白和含体积分数为20%FBS的低温保护剂对猪耳细胞的冻存效果无显著差异,说明丝胶蛋白能有效替代FBS。将体积分数为10%DMSO浓度降至5%,添加体积分数为10%丝素蛋白后,细胞的存活率和贴壁率与对照组相比无明显差异,说明丝素蛋白能降低DMSO的浓度。将质量浓度为1%丝胶蛋白与体积分数为10%丝素蛋白联用后,能达到较好的冻存效果。     

用于1型糖尿病细胞治疗的胰岛低温保存进展

近年来,1型糖尿病细胞治疗技术发展迅速,但供体胰岛的缺乏及供体与受体在时间和空间上的不匹配限制了其在临床上的应用.低温保存技术可以解决该限制,但经传统低温保存方法保存的胰岛存活率和功能性均较差,难以达到临床应用的标准.本文对胰岛低温保存原理及低温保存过程中造成胰岛损伤的因素进行了分类归纳,从冰晶损伤抑制、保护剂损伤抑制...     

微液滴自然蒸发加载低温保护剂的细胞渗透特性与损伤评估

本文提出了一种微液滴自然蒸发加载低温保护剂的方法,借助图像处理技术,结合细胞渗透模型与损伤模型进行理论分析,系统研究了初始体积和初始浓度对微液滴自然蒸发加载低温保护剂过程的细胞渗透特性与损伤的影响,并与传统低温保护剂加载方法(一步加载、两步加载)进行对比。研究结果表明：微液滴的初始体积越小,蒸发速率越快,低温保护剂更易达到目标浓度,能够有效缩短加载时间(1μL相比5μL缩短4 907 s);随着低温保护剂初始浓度的降低,加载时间逐渐增长(0.5 M和2.5 M分别为2 460、1 346 s),但造成的细胞体积变化极值显著减小(0.5 M和2.5 M分别为初始体积的14%和43%),累积毒性损伤也会显著降低(0.5 M和2.5 M分别为23.05、47.53);微液滴自然蒸发加载相比传统加载方法可显著提高细胞存活率与细胞增殖能力(P<0.05),其细胞存活率为96.73%±0.54%,比一步加载提升16%,且培养48 h的细胞贴壁情况显著优于两步加载。表明该新方法能够简化低温保护剂加载流程,并能有效降低细胞损伤。     

海藻糖和胎牛血清对人乳腺细胞HBL-100低温保存的影响

建立高质量的生物样本库至关重要,低温保存过程中保护剂的种类和浓度对样本的冷冻效果有很大影响。本文以人乳腺细胞HBL-100为研究对象,在Me_2SO含量10%的DMEM溶液中分别添加不同浓度海藻糖(0~0.3 mol/L)和不同体积分数FBS(20%~60%)。采用逐步降温法,先在-80℃冰箱中慢速降温4 h,再快速投入到液氮中(-196℃),冻存7 d后,在37℃水浴锅中快速摇晃复温。分别用台盼蓝法、CCK法和24 h贴壁率法检测细胞的成活率,结果表明:与对照组相比,海藻糖和FBS对细胞的冷冻效果都有显著影响。当海藻糖浓度一定时,FBS体积分数越高,细胞的冷冻效果越好,但不添加海藻糖时,FBS的作用不明显;当FBS体积分数一定时,三种检测指标在海藻糖浓度为0.2 mol/L时最优,且高浓度海藻糖可能会抑制FBS作用。考虑成本等因素,最适宜冻存人乳腺细胞HBL-100的冻存液为10%Me_2SO+40%~60%FBS+0.2 mol/L海藻糖。     

Cryopreservation of DNA Origami Nanostructures

Although DNA origami nanostructures have found their way into numerous fields of fundamental and applied research, they often suffer from rather limited stability when subjected to environments that differ from the employed assembly conditions, that is, suspended in Mg²⁺‐containing buffer at moderate temperatures. Here, means for efficient cryopreservation of 2D and 3D DNA origami nanostructures and, in particular, the effect of repeated freezing and thawing cycles are investigated. It is found that, while the 2D DNA origami nanostructures maintain their structural integrity over at least 32 freeze–thaw cycles, ice crystal formation makes the DNA origami gradually more sensitive toward harsh sample treatment conditions. Whereas no freeze damage could be detected in 3D DNA origami nanostructures subjected to 32 freeze–thaw cycles, 1000 freeze–thaw cycles result in significant fragmentation. The cryoprotectants glycerol and trehalose are found to efficiently protect the DNA origami nanostructures against freeze damage at concentrations between 0.2 × 10^?3 and 200 × 10^?3 m and without any negative effects on DNA origami shape. This work thus provides a basis for the long‐term storage of DNA origami nanostructures, which is an important prerequisite for various technological and medical applications.     

冷冻保护剂添加-去除过程对猪MII期卵母细胞损伤研究

在卵母细胞的低温保存过程中,冷冻保护剂的添加与去除是一个必不可少的步骤,但高浓度的冷冻保护剂会对细胞造成渗透损伤和毒性损伤。为研究冷冻保护剂添加与去除过程对猪MII期卵母细胞的损伤,本文采用传统的方法(一步法、两步法)来添加和去除冷冻保护剂,探究冷冻液、解冻液、稀释液对细胞存活率的影响。实验结果表明:在冷冻保护剂添加-去除过程中,卵母细胞的渗透损伤主要发生在卵母细胞从冷冻液转移至解冻液,以及保护剂去除阶段;解冻液浓度与平衡时间对卵母细胞存活率有很大影响;卵母细胞保护剂的去除与添加过程是相关的,解冻液浓度和平衡时间的选择依赖于细胞在冷冻液中的浓度和平衡时间。此研究结果将为猪MII期卵母细胞的低温保存方案提供参考。     

细胞冻融策略优化及设备研究进展

低温冷冻保存是细胞治疗、辅助生殖等生物医学应用的使能技术之一.冷冻和复苏过程中,胞内外冰晶的形成和生长会对细胞产生损伤;其中,升降温速率又与冰晶的形成、生长有密切关系.本文在阐述程序化慢速冷冻和玻璃化快速冷冻两种细胞冻存方式及冷冻损伤两因素假说的基础上,对细胞特性、细胞外环境和升降温策略三个影响细胞冻存效果的要素进行分...     

成纤维细胞预处理过程及三种低温保存方法比较的实验研究

成纤维细胞是构建组织工程化真皮的种子细胞,实现成纤维细胞的低温保存对成功保存组织工程化真皮有着重要的意义.采用三种不同的低温保存方法对成纤维细胞进行低温保存实验;详细介绍这三种方法的操作过程;并从细胞存活率、降温过程中的温度变化情况、操作时所需仪器设备及所耗时间等方面对这三种方法进行了比较.同时研究了DMSO的浓度、预处理时间及预处理温度等因素对成纤维细胞存活率的影响.     

细胞低温保存过程中冰晶成核的研究进展

细胞低温保存过程中,胞内冰损伤是其主要损伤因素之一,这可以通过控制冰晶成核来降低。本文总结了物理、化学及生物控制成核方法在低温保存领域的应用,归纳了各类控制成核方法的机理及对细胞产生的影响,对比得出生物及化学试剂控制成核方法较为优异。并提出最佳成核温度的概念,在该温度下,胞外冰产生且引导细胞适当脱水,减少胞内自由水,降低胞内冰的产生几率,为控制成核在细胞低温保存领域的应用指明了方向。     

PDMS-玻璃微流控芯片上附着态HepG2细胞低温保存条件研究

微流控芯片上细胞样本的低温保存能够显著缩短芯片上细胞实验周期、降低实验成本,有助于芯片上细胞实验的广泛应用。本文对PDMS-玻璃微流控芯片上附着态HepG2细胞的低温保存条件进行了研究,包括降温速率、低温保护剂、低温存储时间及存储温度,确定了芯片上附着态HepG2细胞的低温保存方案。结果表明:采用不同的冷却环境、冷却介质,芯片微通道内能够实现0.36～35.12℃/min的降温速率;芯片上附着态HepG2细胞低温保存存在最优降温速率0.5～1.5℃/min;-20℃或液氮表面上方40 cm处冷却环境与-80℃冷却环境组合冻存能够显著提高芯片上冻存7 d的HepG2细胞存活率;体积浓度为20%的DMSO与0.1 mol/L海藻糖联合能够显著提高芯片上冻存HepG2细胞活性。经过上述冻存条件优化后,芯片上附着态HepG2细胞冻存7 d活性超过90%。