金黄色葡萄球菌DPO-PCR快速检测方法的建立与应用

为建立检测金黄色葡萄球菌(SA)的PCR方法,以SA Sa442基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物(DPO),建立了SA的DPO-PCR快速检测方法。结果显示,在45~65℃退火温度范围内均能高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感,该方法的灵敏度为2.27×102cfu/m L,同时DPO引物特异性强,与其他菌株无非特异性扩增反应。利用该方法和行标法分别对采集的175份样品进行检测,均共计检出13份SA阳性样品,两者符合率为100%。作者建立的DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性,为快速准确检测SA提供新的检测手段。     

创伤弧菌DPO-PCR检测方法的建立

为建立检测创伤弧菌(VV)的快速检测方法,以VV vvhA基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物(DPO),建立了DPO-PCR快速检测VV的方法。结果显示,退火温度范围在49~69℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与VV的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为99 cfu/m L。利用该检测方法对采集的210份样品进行检测,共计检出4份VV阳性样品,与行标法(SN/T 1870—2007)检测结果一致,显示了良好的实用性。该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。     

副溶血弧菌DPO-PCR检测方法的建立

以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)toxR基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸(DPO)引物,建立了DPO-PCR快速检测VP的方法。结果显示,退火温度在49~69℃都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与VP的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为121 CFU/m L。利用该检测方法对采集的550份样品进行检测,共计检出19份VP阳性样品,与行标法(SN/T 1870-2007)检测结果一致,实用性良好。该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。     

链置换恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

目的开发单核细胞增生李斯特氏菌快速、简便、准确的链置换恒温扩增(strand displacement amplification,SDA)检测方法。方法根据单核增生李斯特菌特异性基因prfA基因片段,设计链置换扩增特异性引物,建立单核细胞增生李斯特菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的特异性和灵敏度进行研究。结果所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA扩增方法灵敏度达到了7.0×10~2 CFU/mL,检验技术可以特异性地扩增单核增生李斯特菌。结论本试验所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA检验技术具有快速、简便、特异性强的特点,具有在进出口实验室推广应用前景。     

改良FTA-PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

目的：建立快速、特异、灵敏的单核细胞增生性李斯特氏菌的PCR 检测方法。方法：以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA 基因作为靶序列设计一对引物,运用改良的FTA-PCR 法对单核细胞增生李斯特氏菌进行鉴定和检测。结果：扩增产物为136bp 的片断,此方法较原有方法灵敏度增强,可达到1.1 × 102CFU/ml。结论：改良的FTA 卡法特异性强、灵敏度高,有效缩短了检验周期,从传统的7～14d 缩短到1～1.5d。     

FTA滤膜用于PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的研究

建立单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria moncytones,LM)快速、敏感、特异的PCR检测方法.利用FTA滤膜提取模板DNA,采用PCR特异性扩增单增李斯特菌的溶血素基因(HIyA),并评价该方法的特异性与灵敏性.引物能特异性的扩增单增李斯特的HIyA基因,而其他细菌的扩增结果均呈现阴性:利用FTA滤膜提取模板直接检测单增李斯特具有较高的灵敏度,灵敏度为l 02 cfu/mL.利用FFA滤膜提取模板,操作简便,成本低且具有较高的灵敏度,为食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测提供新的手段.     

应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

利用双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE 基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法, 其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实 验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法 设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。     

双启动寡核苷酸聚合酶链式反应法检测食品中的沙门氏菌

目的建立检测食品中沙门氏菌的双启动寡核苷酸-聚合酶链式反应(dual priming oligonucleotide-polymerase chain reaction,DPO-PCR)方法。方法以沙门氏菌invA基因为靶基因设计一对DPO引物,优化条件,对180份熟肉样本同时进行DPO-PCR和细菌分离鉴定。结果 DPO-PCR方法退火温度在52、57、62℃均可对靶基因高效扩增。方法特异性好,仅对沙门氏菌为阳性结果,而对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、β溶血性链球菌、铜绿假单孢菌无交叉反应。方法灵敏度可达4.3×10~2 CFU/mL。与细菌分离鉴定相比,两者检测结果完全一致。结论该方法快速、精准,可作为食品中沙门氏菌的快速检测方法。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度(LAMP)检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly A基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。     

基于双启动引物PCR方法检测溶藻弧菌的研究

为建立检测溶藻弧菌(VA)的快速检测方法,试验以VA Collagenase基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物(DPO),建立了DPO-PCR快速检测VA的方法。结果显示,退火温度范围在48℃~68℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与VA的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为1.14×102 CFU/m L。利用该检测方法对采集的550份样品进行检测,共计检出4份VA阳性样品,与商检行业标准(SN/T 1870—2007)检测结果一致,显示了良好的实用性。该DPOPCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术检测单核细胞增生李斯特氏菌。根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定。通过检测70?种实际食品样品对SRCA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果表明：所有单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性结果,非单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果,说明该方法特异性良好。SRCA方法的灵敏度为8.9×100?fg/μL,是传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法的1?000?倍,检出限为2.8×100?CFU/g,是传统PCR方法的1/1?000。在实际样品的检测中,SRCA方法与GB?4789.30—2016《食品微生物学检验?单核细胞增生李斯特氏菌》方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、97.01%和97.14%。可视化SRCA技术具有操作简便、设备简单、特异性强、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点,适合在基层单位和中小型食品企业中推广应用。     

5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测方法

为建立食品中单核细胞增生性李斯特氏菌 (单增李斯特氏菌 )的快速、敏感、特异的PCR检测方法 ,选取hlyA基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 6 3株从国内食品中分离的李斯特氏菌 (进行传统方法验证 )和 2 0株非李斯特氏菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测 ,扩增片段表现出极好的单增李斯特氏菌种特异性 ,人工污染的生肉、冷冻虾仁、卷心菜的检出限为 39cfu g ,为食品中单增李斯特氏菌的快速、敏感并且特异的检测方法。     

单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

以单核细胞增生性李斯特氏菌的hly基因为靶基因,用Primer 5.0设计了特异性兼并引物,建立荧光定量PCR检测方法。并用阳性质粒标准品、不同菌株对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,且在人工污染鲜切甜瓜上对该方法进行了初步应用。结果表明,建立的检测方法特异性强、灵敏度高,对阳性质粒标准品的灵敏度为7.69×10copies/μL,对人工污染的鲜切甜瓜中单核细胞增生性李斯特氏菌的最低检出限为3.11×10cfu/mL。     

环介导等温扩增法检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌

目的采用环介导等温扩增技术检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌。方法在北京市范围内各业态餐厅购买600份凉菜样品为研究对象,以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因为目标基因,设计4条特异性引物,使用环比等温扩增法(loop-to-isothermal amplification, LAMP)创建凉菜中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法并将其应用于鉴定凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌。结果通过细菌分离培养法对600份凉菜进行检测,一共检测分离出37株致病菌菌株,其中包括7株单核细胞增生李斯特氏菌、10株沙门氏菌和20株大肠埃希氏菌,单核细胞增生李斯特氏菌的检出率为1.2%。用LAMP对样品中的菌株进行测定,7株凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌为阳性,其他菌株为阴性。通过LAMP方法检测动植物源性凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌平均检出限为2.2*10 CFU/μL、特异性为100%。动物源性凉菜中的致病菌含量较高。结论环介导等温扩增法具备灵敏、快速、操作简便的特点,适合用于餐饮行业的现场快速检测领域。     

实时荧光HDA法快速检测单核细胞增生李斯特菌

目的：建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增（helicase-dependentisothermal DNA amplification,HDA）快速检测方法。方法：针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10 株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果：实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075 μmol/L,反应温度及反应时间为65 ℃、80 min（40 个循环）,具有良好的特异性和灵敏度。结论：建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。     

PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

目的 建立结合PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法.方法 根据单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因设计扩增引物和测序引物,特异地扩增目的片段,再制备单链模板,在测序引物引导下进行焦磷酸测序,通过测序结果与GenBank中的hly基因序列的比对进行鉴定.结果 扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,16株单核细胞增生李斯特氏菌菌株均扩增出大小249 bp的DNA片段,焦磷酸测序结果与hly基因序列100％匹配,而阴性对照菌株均未扩增出DNA条带,焦磷酸测序结果为阴性.结论 建立的方法特异性高,是快速从DNA序列水平上检测单核细胞增生李斯特氏菌的有效手段.     

LAMP检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

单核细胞增生性李斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致病菌.为了鉴定该菌,以单核细胞增生性李斯特氏菌的李氏溶血素基因(Hly)为靶基因,通过环介导等温扩增技术(LAMP)对该基因进行扩增.共对12株菌进行了LAMP检测,结果表明:单核细胞增生性李斯特氏菌为阳性,其它菌株均为阴性.采用LAMP对单核细胞增生性李斯特氏菌纯培养进行检测,其方法的灵敏度为7.3×101cfu/mL;而利用LAMP检测人工污染的鸡肉中的单核细胞增生性李斯特氏菌,检出限为8.9×101cfu/g.     

双重荧光定量PCR检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

目的建立双重荧光定量PCR方法,快速检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌。方法通过设计特异性引物和探针,扩增沙门菌的fimY基因和单核细胞增生李斯特菌的hly基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外7株肠道致病菌评价检测体系的特异性;建立了沙门菌和单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了同时检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2.5 h。检测两种病原菌的灵敏度分别为11和12.8 copies/μl,特异性为100%,符合率为93.3%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中很有应用前景。     

产志贺毒素大肠杆菌O26多重双启动寡核苷酸引物-PCR检测方法的建立

为建立一种三重DPO-PCR方法用于食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌O26的检测。以志贺毒素stx1和stx2、O抗原基因wzx O26特异性和实际检测效果,设计引物,构建三重DPO-PCR反应体系,进行特异性、灵敏度、模拟样品验证和实际样品验证。结果表明,三对DPO引物对退火温度不敏感,在49~69℃之间均能发生扩增,且引物之间干扰较小,具有较高的特异性,除目的基因外非目标细菌均无扩增条带出现,纯菌灵敏度检测表明,三重DPO-PCR方法对O26的最低检测限为3.8×10^3 cfu/g。在模拟样品和实际样品中具有良好的检测效果。本研究基于DPO引物构建的三重DPO-PCR方法具有效率高,特异性强,不受退火温度限制等优点,可用于食品样品中产志贺毒素大肠杆菌O26的快速准确检测提供一种高效的辅助检测方法。