植物细胞悬浮培养

<正>植物细胞能合成许多具有重要价值的次级代谢产物,它们可作为农药、杀虫剂、调味剂及香精等。这些产物传统上是从天然植物中直接提取,但天然植物生长周期较长,而且生长还受地域和环境因素的限制,所以采用直接提取具有较大的局限性。化学合成法已用于多种产品的生产,但是有些物质不能通过化学法合成,或虽能合成,却比较困难。植物     

生物反应器高密度无血清培养全悬浮MDCK细胞和流感病毒工艺的建立

目的 优化生物反应器高密度无血清培养全悬浮MDCK细胞和流感病毒的条件,并放大培养规模,建立MDCK细胞和4种型别流感病毒的培养工艺。方法 分别在不同溶氧（DO）、pH、转速、接种密度条件下培养MDCK细胞,每24 h取样计数,优化细胞培养条件后,放大至50 L生物反应器,并接种4种型别流感病毒（H1N1:A/California/7/2009、H3N2:A/Texas/20/2012、BV:B/Brisbane/60/2008、BY:B/Phuket/3073/2013）,接毒条件为MOI=10-4,胰酶终浓度为15μg/mL,细胞密度为（1.8～2.2）×106个/mL,病毒维持液为DMEM,培养温度为甲型34.5℃、乙型33.5℃,检测病毒血凝效价、病毒滴度（CCID50）和血凝素（hemagglutinin,HA）含量。结果 在5 L及50 L生物反应器中培养MDCK细胞,活细胞密度均可在72 h后达到8.0×106个/mL,活率在95%以上;H1N1、H3N2、BV、BY的血凝效价分别为7、11、9、9 log2(HAU/25μL),CCID50均达6.5以上,HA含量分别为...     

发状念珠藻细胞液体悬浮培养的研究

为解决天然发状念珠藻生长缓慢的问题,从天然藻体中分离出细胞对其进行液体悬浮培养。结果表明,液体悬浮培养可以显著提高发状念珠藻细胞的生长速度,同时提高发状念珠藻胞外多糖的产量。采用BG-11培养基,添加2.5 g/L硝酸钠,培养温度25℃,光照强度40μmol/(m2.s),转速130 r/min,培养20 d细胞干质量浓度达到1.05 g/L,胞外多糖产量89.9 mg/L。培养发状念珠藻细胞的基本成分和细胞培养液的HPLC指纹图谱分析表明其生化组成和多糖的合成与天然发状念珠藻相似。与其他人工培养方法相比,液体悬浮培养更适合大规模工业化生产。     

硝酸银作用下南方红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇动力学研究

研究了诱导子硝酸银对红豆杉细胞培养生产紫杉醇的影响,表明１０μｍｏｌＬ＾－１的硝酸银量有利于紫杉醇的生成,并通过动力学模型对硝酸银的作用位点进行分析,确定了硝酸银在紫杉醇代谢路径中的作用位点位于ＢａｃｃａｔｉｎⅡ和紫杉醇之间。     

剪切力对南方红豆杉细胞悬浮培养的影响

考察了流体剪切力对南方红豆杉悬浮细胞线粒体活性、膜透性、培养液pH、酚积累以及氧迸发等的影响. 结果表明，指数后期或稳定前期的南方红豆杉细胞对剪切力更为敏感，细胞生物活性丧失较大，次生代谢物酚的积累更多；此外，剪切力还引起了红豆杉细胞的防御应答反应，如H+内流、酚类物质大量积累以及活性氧迸发.     

紫草细胞悬浮培养的动力学

通过对紫草细胞进行悬浮培养,测定了培养基中碳源、氮源、磷酸盐等无机元素的变化;并分析了细胞结构性组分、细胞呼吸以及次生代谢产物紫草宁的合成情况,探索研究了细胞培养的内在规律,为建立结构化动力学模型奠定了基础。     

剪切应力对红豆杉细胞悬浮培养的影响及CFD模拟研究

在同轴圆筒装置的均匀剪切场中研究了不同剪切应力(0.16, 0.46, 0.78Pa)对悬浮培养的南方红豆杉细胞生理的短期影响。结果表明剪切应力为0.16~0.46Pa时,有利于细胞的生长和初生代谢;剪切应力为0.46~0.78Pa时, 有利于细胞的次生代谢;另一方面利用计算流体力学(CFD)对20L生物搅拌釜(45-斜向上桨(45-PBT),桨距为(1/3)T的流场进行了三维模拟,获得搅拌釜内部的剪切场。结果表明搅拌釜内剪切应力分布极不均匀, 且主要集中在搅拌桨区和尾流区,约为主流区和挡板区值的3~5倍,有时甚至高达7倍。通过将实验结果和CFD模拟相结合,预测了20L生物搅拌釜剪切应力对南方红豆杉细胞生理的影响。表明当搅拌转速小于150 rmin-1时,搅拌釜内相应的剪切应力有利于细胞的生长和初生代谢;而当搅拌转速大于200 rmin-1时,则不宜于南方红豆杉细胞的培养。     

电刺激对红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇的影响

以红豆杉悬浮培养细胞为材料产紫杉醇,在细胞生长的不同时期分别用脉冲电刺激及微交流电刺激处理。结果表明,两种电刺激均不同程度促进了红豆杉悬浮培养细胞的生长、紫杉醇的产生,其中脉冲电刺激效果优于微交流电刺激。最佳作用时间是在红豆杉细胞生长的衰亡期,微交流电刺激的紫杉醇含量较对照提高3倍多,脉冲电刺激的紫杉醇含量约为对照的7~9倍,最高达到12.24 mg.L-1。脉冲电刺激可有效提高紫杉醇的胞外释放率,达对照的4~5倍。     

有机溶剂原位萃取法提高悬浮培养中国红豆杉细胞紫杉醇产量

The production of paclitaxel from suspension culture of Taxus chinensis var,mairei was improved by in situ extraction with organic solvents to avoid feedback repression and product degradation.Oleic acid and dibutyl phthalate were proved to be suitable solvents .The optimal volumetric percentage of organic solvents in the culture medium was found to be around 8%,and the favorable time for their introduction was at the exponential phase of cell growth,Paclitaxel production with the in situ extraction was ca 3-fold of that without extraction.     

寡聚糖诱导悬浮培养红豆杉细胞生理态势的改变

运用顺磁共振、电镜、能谱等手段研究了寡聚糖对红豆杉细胞氧化还原生理态势的影响 .结果表明 ,诱导前红豆杉细胞处于相对稳定的生长态势 ,细胞完整 ,细胞器发达 ;氧化还原电势较低 ,活性氧相关酶系统相对稳定 ,细胞初生代谢旺盛 ,紫杉醇合成速率很低 .诱导后红豆杉细胞向产物合成态势转移 ,SOD酶活性迅速提高 ,CAT和POD酶活被强烈抑制 ;细胞出现活性氧迸发 ,4h达最大值 ;细胞的氧化还原电势增高 ,细胞膜上离子通道被激活 ,H⁺ 和Ca^{2 +} 内流 ,Cl^-外流 ;液胞内出现大量含Ca^{2 +} 离子的高电子致密区并呈规律性变化 ,培养环境碱化 ;细胞生长被抑制 ,紫杉醇合成速率升高 ,其产量提高了 5.5倍 ,达 76.1mg·L^-1.     

流感疫苗诱导Hela细胞凋亡与免疫调节效应

目的观察流感疫苗诱导Hela细胞凋亡与免疫调节效应。方法将流感疫苗作用于Hela细胞,采用MTT比色法和流式细胞仪检测疫苗对Hela细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;同时用MTT法检测疫苗对小鼠脾细胞增殖的影响;采用结晶紫、中性红染色及MTT法,分别检测脾细胞诱导上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌情况。结果一定浓度流感疫苗能够抑制Hela细胞增殖,促进细胞凋亡,凋亡率可达58·37%;还可促进小鼠脾细胞增殖及Th1型细胞分泌IFN-γ。结论流感疫苗能够抑制Hela细胞增殖,此作用可能是通过诱导Hela细胞凋亡、调节免疫细胞增殖及IFN-γ的分泌而实现的。     

无血清摇动悬浮培养富集乳腺癌干细胞

目的探讨不同培养条件下乳腺癌MCF-7细胞的分裂特点,建立快速、有效的乳腺癌干细胞富集方法。方法将MCF-7细胞分别采用完全培养基静置培养(A组)、完全培养基摇动培养(B组)、细胞因子静置培养(C组)和细胞因子摇动培养(D组)12、24、36 h,倒置相差显微镜下观察各组细胞分裂情况,计算克隆形成率,采用流式细胞术检测CD44+/CD24-/low细胞亚群的比例变化。结果 B组和C组培养12 h,棒状分裂细胞约占30%;24 h后分别约占50%和60%;36 h后形成大的细胞克隆。D组培养12 h,棒状分裂细胞约占50%;24 h后约占80%,可见多个细胞克隆;36 h后克隆细胞数减少。D组培养12 h,CD44+/CD24-/low细胞亚群比例(8.05%)为B组(0.99%)的8倍,C组(3.80%)的2.1倍;培养24 h,D组(15.24%)为B组(4.83%)的3倍,C组(2.30%)的6倍;培养36 h,D组CD44+/CD24-/low细胞亚群比例降至9.68%,约为B组(0.95%)和C组(1.03%)的9倍。结论在细胞因子摇动培养条件下,MCF-7细胞分裂加快,分裂象增多,细胞系中CD44+/CD24-/low亚群比例增加较快,干细胞池增加明显,表明无血清摇动悬浮培养为富集乳腺癌干细胞的快速、有效的方法。     

微小隐孢子虫CP15/60基因在Hela细胞中的表达

目的 构建隐孢子虫CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,观察其在Hela细胞中的表达。方法用Xho I和EcoR　I从pMD18-T-15/60中酶切得到CP 15/60基因,将其插入真核表达载体pCR3.1（+）的 XhoI和EcoRI位点,构建CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,用RT-PCR方法检测外源CP15/60基因的转录,ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-15/60,外源CP15/60基因能在转染细胞中有效转录,经检测表达产物具有良好的生物活性。结论 已成功地构建了pcDNA3.1-15/60真核表达载体,并在Hela细胞中具有良好的表达。     

抗人A血型杂交瘤细胞高密度培养条件的研究

抗人 A 血型杂交瘤15B_4细胞在 CelliGen 细胞培养罐中进行连续灌注培养,细胞密度达1.6×10~7/ml。每天灌注新培养液量由1000ml 增到2300ml,第14天后又逐日减少至1000ml,死细胞数随着转速的增加和灌注量的减少而增多。血凝效价呈梯度上升,滴度达到2~(14),相当于腹水效价。培养6天 IgM 产量为0.2克/升/天,10～18天波动在1.45～1.8克/升/天。15B_4细胞代谢与葡萄糖、乳酸有关,与氨无关。CelliGen 自控效果较好,适用于杂交瘤细胞的高密度培养。搅拌速度在120～150r/min 对细胞产生的剪切力有明显地破坏作用。溶氧控制系统有待改进。     

用高效廉价载体培养CHO细胞生产rHuEPO的研究

研究了以自制胶原蛋白载体及C-DISK载体培养CHO细胞生产rHuEPO蛋白的过程,并以进口A-DISK载体作为对照培养。对培养过程中细胞贴壁过程、葡萄糖代谢速率、rHuEPO浓度及葡萄糖代谢速率与rHuEPO的浓度变化关系进行了实验研究分析和对比。结果表明:自制胶原蛋白载体培养细胞具有良好的生物代谢活力和蛋白表达能力,葡萄糖代谢速率高达14.2mmol?mL?1?h?1,比自制C-DISK载体高16.4%,比进口A-DISK载体高12.7%;在自制胶原蛋白载体上培养CHO细胞时EPO表达量也最高,培养10天后EPO浓度达到282U?mL?1,比自制C-DISK载体高30%,也比进口A-DISK载体高18%。自制胶原蛋白载体具有较佳的性价比,是一种高效、廉价的动物细胞培养载体。细胞的葡萄糖代谢水平对蛋白表达有着重要的影响,但两者又不同步,因此可用葡萄糖的代谢速率变化对该培养过程和目的蛋白表达进行适当监测和调控。     

rCHO细胞在葡萄糖限制流加培养过程中的生长与代谢特性

以调控rCHO细胞的葡萄糖代谢为主要研究目标,通过在2L生物反应器中进行的批培养和葡萄糖限制恒速流加培养的方法,考察了在培养过程中葡萄糖浓度对rCHO细胞生长、葡萄糖和谷氨酰胺消耗,以及副产物乳酸、氨和丙氨酸生成的影响.结果表明:葡萄糖限制的流加培养过程中,活细胞密度XV达到2.35(106cells(mL(1,较批培养提高一倍;而乳酸生成大幅减少.在葡萄糖限制培养阶段,qLac和YLac/Gluc持续降低至零,而qo2/qGluc由0.7 mmol(mmol(1上升至4.3mmol(mmol(1,说明更多葡萄糖进入高效释能代谢途径.同时谷氨酰胺的消耗增加,YAmm/Gln增大,YAla/Gln下降,证明谷氨酰胺的能量利用率也有所提高.     

牛布氏杆菌抗独特型杂交瘤细胞的悬浮培养研究

牛布氏杆菌抗独特型杂交瘤细胞F9株能稳定地分泌高效价的抗独特型抗体,其Ig类型为IgG2a,并具有抗原“内影象”和良好的免疫原性。该细胞培养在Techne－T104型1．5L细胞培养装置中,最适连续培养条件是pH7．1～7．5;36．5±0．5℃,搅拌速度35～45r／min。在连续悬浮培养时,细胞密度维持在3．2×105～8．2×105／ml,单克隆抗独特型抗体浓度可达1．04mg／ml,培养上清ELISA捕获法效价达1：160。     

悬浮吸附法在人胚肺二倍体细胞(KMB17)中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒

目的研究在KMB17细胞中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒及其用于生产疫苗的可行性。方法应用悬浮吸附和添加血清的方法,在KMB17细胞上培养SabinⅠ、Ⅱ、中Ⅲ2型病毒,用微量法检测病毒滴度。结果在悬浮吸附加10%血清培养条件下,SabinⅠ滴度可达8.125 LgCCID50,SabinⅡ滴度可达7.5 LgCCID50,中Ⅲ2滴度可达7.583 LgCCID50。与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度比较,差异无显著意义(P>0.05)。结论可进一步研究应用KMB17细胞进行疫苗生产。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

兔骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离培养及鉴定。方法自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化出MSC,并增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,流式细胞仪检测第3代MSC表面抗原的表达情况。结果体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;MSC阳性表达CD29,CD90,但CD34,CD45呈阴性。结论利用密度梯度离心法获取的MSC具有大量增殖的能力,表达CD29,CD90,不表达CD34,CD45。