白首乌甾苷元C11α-羟基化的两种微生物转化

以自三峡白首鸟提取分离得到的C21甾苷元告达庭甾苷元和开德甾苷元作为底物,采用黑根霉(Rhizo pusnigricans)和赭曲霉(Aspergillus ochraceus.)两种微生物在水一正丁醇双相体系中,以连续转化或同步转化的方法制备Cllα-羟基化的白首乌C21甾苷元告达庭甾苷元和开德甾苷元,羟化反应控制pH值在5.0～6.0,于30℃下振荡培养70 h.产物经红外、紫外、质谱、核磁共振图谱分析表征.结果表明,同步转化法相对较好,其副产物少,收率达74.1%.     

新月弯孢霉KA-91转化异羟基洋地黄毒苷元的研究

考察了新月弯孢霉(Curvularialunata)KA-91对地高辛和异羟基洋地黄毒苷元的生物转化反应。结果发现,新月弯孢霉KA-91对地高辛不具有转化能力,对异羟基洋地黄毒苷元转化产生一个产物,经结构鉴定产物为3-羰基-异羟基洋地黄毒苷元。确定了转化异羟基洋地黄毒苷元反应的最优工艺参数为:发酵培养基的初始pH值6.0,装液量50 mL.(250 mL)-1,底物浓度0.60 mmol.L-1,转化温度28℃,180 r.min-1振荡培养24 h,转化54 h。此时,转化率为40%。     

黑根霉RN-M246催化甾体的11α-羟基化培养基研究

应用微生物转化法,以黑根霉RN-M246催化底物雄甾-4-烯-3,17-二酮的11α-羟基化反应,考察了发酵培养基对转化的影响,分别从碳源、速效有机氮源、迟效氮源、无机氮源及pH值5个方面优化了发酵培养基。确定优化的发酵培养基（g·L-1）为：葡萄糖30、蛋白胨20、冷榨豆粉10、柠檬酸三铵1、磷酸氢二钾5、pH值5.0,在优化条件下,可提高转化率约13%,最终转化率达48.4%。     

雷斯青霉15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮的发酵工艺优化

利用雷斯青霉(Penicillium raistrickii)的特异性转化酶对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮进行15α-位羟基化,制备了重要的激素药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮.以种龄、接种量、投料量、pH值控制、溶氧控制、投料和转化时间等影响因子为对象对其发酵罐二级发酵工艺进行了优化.确定0.2%投料量条件下最优发酵工艺条件为:种龄21 h;接种量5%;0～27 h,pH值7.5、溶氧40%;27～66 h,pH值6.0、溶氧20%;投料时间第30 h;转化时间42 h.在此条件下,转化率可达65%以上,比优化前提高了11.4%,为药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的进一步扩大发酵转化以及工业化生产奠定了基础.     

16α，17α-环氧黄体酮C11β-羟基化微生物的选育

从S418黑根霉，蓝色犁头霉，蓝色犁头霉D1、D2、D5，新月弯孢霉X1、X2和雅致小克银汉霉8种菌株中筛选出能高效转化生产C11β-羟基-16α，17α-环氧孕酮的菌株-雅致小克银汉霉，并经低能氮离子注入诱变，获得一株性能稳定的银汉霉突变株，在28℃下摇瓶发酵22h，48h后投料，C11β-羟基-16α，17α-环氧孕酮的转化率达到5．8％，比最初的转化率提高30％。     

短刺小克银汉霉菌11β羟化环氧黄体酮研究

采用短刺小克银汉霉菌(Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a)催化底物环氧黄体酮进行11位羟基化反应,将转化产物分离纯化得到晶体,经过质谱、红外光谱和核磁共振氢谱表征,结合产物的比旋光度测定,证实霉菌催化转化主产物是11β-羟基-16α,17α-环氧孕甾-4-烯-3,20-二酮。对霉菌发酵转化的培养基组成、操作条件和投料方式等进行了考察,确定了比较适宜的工艺条件,在2 g.L.1投料浓度下,环氧黄体酮的11β羟化产物得率稳定在35%左右;采取发酵液稀释补料投料方式,可有效地将产物得率从35%提高到43%。利用C.blakesleeana成功地实现了直接11β羟化环氧黄体酮,为甾体糖皮质激素类药物的生产提供了一条简化的合成路线。     

赭曲霉对16α,17α-环氧黄体酮的C_(11)α-羟基化工艺研究

研究了赭曲霉对16α,17α-环氧黄体酮(EP)的C11α-羟基化工艺条件。考察了接种量、摇床转速、底物投料方式及投料时间等工艺参数对转化率的影响,初步确定最佳转化工艺条件如下:转化培养基初始pH值为5.0、接种量为2.0%、摇床转速为200 r.min-1、28 h时投加乙醇溶解的EP、EP浓度为10 g.L-1,此条件下转化率达80.5%。将羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)应用于转化反应中,在转化反应进行4 h时添加与EP摩尔比为1.25∶1的HP-β-CD,转化率达到93.1%,较未添加HP-β-CD的转化率提高了12.6%。     

由胆甾醇制备2-苯亚甲基-5α-胆甾烷-3-酮

以胆甾醇(■)为起始原料,通过10%Pd-C催化加氢还原合成5α-胆甾烷-3β-醇(■),■经Jones试剂氧化反应,得到5α-胆甾烷-3-酮(■),■经NaOH催化与苯甲醛发生Claisen-Schmidt缩合生成2-苯亚甲基-5α-胆甾烷-3-酮(■)。对制备工艺进行了优化,确定加氢反应的条件为:乙醇溶液中,25℃反应20 h;Jones试剂氧化反应的条件为:丙酮溶液中30℃反应2 h;Claisen-Schmidt缩合反应的条件为:乙醇溶液中,在NaOH催化下先25℃反应2 h,再升温至50℃反应3 h。优化条件下,3步反应总收率74.7%。产物结构经~1H NMR、~(13)C NMR和APCI-MS确证。     

7α-甲基-19-醛基-4-雄甾烯-3,17-二酮合成工艺改进

采用7α-甲基-17,19-二羟基-4-雄甾烯-3-酮为原料,二氯甲烷为溶剂,在温和的氧化剂PCC的作用下合成了标题化合物。并对其合成工艺进行了探索和优化,优化的最佳反应条件是7α-甲基-17,19-二羟基-4-雄甾烯-3-酮,二氯甲烷和PCC氧化剂的投料比为20g∶250mL∶(60～65)g;反应温度为23℃～27℃,反应时间为3h,质量收率为85%。PCC氧化法具有反应可控,产率较高等优点。     

全细胞生物催化麻疯树油制备生物柴油的研究

利用石油醚直接浸提法抽提得到含油率达到55.84%的麻疯树籽油作为原料,采用米根霉(Rizopus oryzae)菌株和聚氨酯泡沫制备成固定化全细胞生物催化剂,通过对全细胞生物催化法制备生物柴油的主要工艺参数进行了优化,获得最佳工艺条件为:当甲酯化反应的醇油比为6:1,转酯化温度为35℃,转酯化体系中2%～20%质量分数的含水率,菌体量相当于油质量的4%,每12 h加入一次甲醇的条件下转酯化效果最好,甲酯得率达到82.29%.同时固定化全细胞生物催化剂的重复使用性达4次,具有较高的催化性能.     

刺孢小克银汉霉9980生物酶法制备D-苯丙氨酸

筛选到一株产氨基酰化酶的真菌刺孢小克银汉霉9980,直接利用其菌体细胞拆分N-乙酰-DL-苯丙氨酸,最终制得D-苯丙氨酸.最适反应条件为0.2 mol/L N-乙酰-DL-苯丙氨酸(含Co2+5×10-4 mol/L),0.04 g/mL菌体,在pH值为7.0、50 ℃条件下反应24 h,拆分率达90%以上.产物经JK008阳离子交换树脂分离.N-乙酰-D-苯丙氨酸经6 mol/L HCl加热回流4 h脱乙酰得D-苯丙氨酸.D-Phe[α]20D=+34.4°(水溶).     

雷斯青霉15a-羟基化左旋乙基甾烯双酮的发酵工艺优化

利用雷斯青霉（Penicillium raistrickii）的特异性转化酶对甾体化合物左旋乙基甾烯双酮进行15a-位羟基化,制备了重要的激素药物中间体15a羟基左旋乙基甾烯双酮。以种龄、接种量、投料量、pH值控制、溶氧控制、投料和转化时间等影响因子为对象对其发酵罐二级发酵工艺进行了优化。确定0．2％投料量条件下最优发酵工艺条件为：种龄21h;接种量5％;0～27h,pH值7．5、溶氧40％;27～66h,pH值6．0、溶氧20％;投料时间第30h;转化时间42h。在此条件下,转化率可达65％以上,比优化前提高了11．4％,为药物中间体15a-羟基左旋乙基甾烯双酮的进一步扩大发酵转化以及工业化生产奠定了基础。     

固定化多酚氧化酶催化合成邻苯二酚

利用壳聚糖固定化蘑菇多酚氧化酶催化氧化苯酚合成邻苯二酚,考察了固定化多酚氧化酶羟基化反应条件对目的产物产率的影响.确定适宜的羟基化工艺条件为:以氯仿为溶剂、底物浓度为20 mmol·L-1,pH值为7.0,含水量为0.9%、温度为30℃、反应时间为5 h,在此条件下催化合成邻苯二酚的产率为11.02%.     

丝瓜络固定化米根霉催化光皮树油制备生物柴油

近年来,全细胞生物催化剂应用于生物柴油生产的研究引起了人们的极大关注,全细胞催化剂的制备过程可省去烦琐的酶纯化过程和降低催化剂的制备成本,且全细胞催化剂使用寿命较长。本研究对一株高产脂肪酶的米根霉进行了固定化研究,并将其应用于生物柴油的制备。首先筛选不同的生物基固定化材料,探索其适宜的固定化条件,以获得的固定化米根霉作为全细胞催化剂催化光皮树油制备生物柴油,探讨了转酯化条件对生物柴油得率的影响。研究结果表明,丝瓜络作为固定化材料的固载率最高,以橄榄油作为碳源,多聚蛋白胨和NaNO₃作为复合氮源,获得的固定化细胞的固载率及脂肪酶活性最强。以丝瓜络固定化米根霉催化光皮树油,在含水量为10%、催化剂用量为12%的反应体系中,总醇油摩尔比为4∶1,甲醇分别在0h、10h、24h、40h以1∶1添加,甲酯得率可达94%以上。固定化全细胞重复使用6次后,转酯化效果依然保持在80%以上。     

固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸

部分纯化的变异三角酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)在碱性条件下变性过氧化氢酶,再与大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯高聚物共价交联。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度升高,最适pH范围变宽,对温度和pH的稳定性都有明显的提高。固定化DAO在搅拌反应器中催化头孢霉素C(CPC)转化为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸(Gl-7-ACA)。以0.03g/mL的CPC为底物,在温度25℃、pH7.2条件下,产物的得率>93%,副产物得率<5%。经过110批反应后,固定化酶保持64%的初始活力。     

复合载体固定化大肠杆菌制备γ-氨基丁酸

用卡拉胶与明胶复合载体固定大肠杆菌,优化了固定化细胞的制备条件,并利用该复合载体固定大肠杆菌细胞进行酶法制备γ-氨基丁酸的研究。实验结果表明,最佳工艺条件为:m(卡拉胶):m(明胶)=3:2,ρ(混合胶)=12g/L,ρ(KCl)=60g/L,固定化时间为3h,ρ(菌体)=80g/L,反应温度为37℃,转化体系pH=4.8,ρ(底物)=40g/L。固定化细胞在最适条件下比酶活高达10740U。包埋1.0g湿菌体的固定化细胞重复使用7次,可把42gL-谷氨酸完全转化为γ-氨基丁酸。     

黏土吸附法固定化脂肪酶的初步研究

为研究天然黏土为载体固定化脂肪酶的可行性,采用羟基化、硅烷化处理,对黏土进行改性,并以此为载体吸附固定化脂肪酶,探讨黏土固定化脂肪酶的条件对酶活及蛋白吸附量的影响,优化固定化脂肪酶条件。研究结果表明:黏土经羟基化、硅烷化改性处理后能显著提高固定化酶活和蛋白固定量,其中硅烷化改性最优;载体固定脂肪酶最优条件为:加酶量50 mg/g,载体粒径180—250μm,pH值为4.0,固定化温度25℃,固定化时间2.0 h;与游离酶相比,固定化酶显示出更广的pH值适应性。黏土固定化脂肪酶重复使用10批次后,仍能保留76.85%的初始活力。以天然黏土为载体固定化脂肪酶,具有较好的实际可应用性及操作稳定性,在较低pH值条件下应用具有一定优势。     

α-溴-4-羟基苯乙酮的合成研究

在硫酸催化下,用4-羟基苯乙酮α-溴化合成了α-溴-4-羟基苯乙酮。对反应条件进行了研究和优化。优化条件:反应物摩尔比为1.0∶1.0,反应温度65~70℃;硫酸用量为反应物酮的70%(质量比),反应时间4 h。优化条件下收率83.5%。     

N+离子注入选育高转化15α-羟基左旋乙基甾烯双酮雷斯青霉菌株的研究

应用离子注入技术,对能转化左旋乙基甾烯双酮为15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的雷斯青霉(Penicillium raistrickii)进行研究,旨在提高其C15α位羟化能力.结果表明,雷斯青霉存活率曲线呈典型的"马鞍型",通过液相色谱分析,在N+注入剂量为50×1014ions·cm-2时可引起较高的正突变率,并从中获得一突变株,其15α-羟基左旋乙基甾烯双酮转化率达到62.7%,为出发菌株的1.16倍.     

重组里氏木霉粗酶液提取虎杖中白藜芦醇的研究

为从虎杖中提取白藜芦醇并同步实现高效转化,经平板初筛和48 h的试管产酶复筛,从619株里氏木霉的基因重组菌中定向筛选出3株高产β-葡萄糖苷酶的菌株(BG-2,BG-4和BG-5)。摇瓶条件下产酶48h,三者的β-葡萄糖苷酶酶活为1.75,3.50和5.71 IU×m L~(-1),分别是出发菌株的36倍、73倍和119倍。以三者的发酵粗酶液直接处理虎杖粗提物,45℃条件下反应5 h后,与出发菌株相对比,重组菌株对白藜芦醇的提取率可达14.86~16.41 mg×g~(-1),是出发菌株的2.41~2.66倍;转化率可达120.5%~138.4%,是出发菌株的6.0~6.85倍,且反应液中基本无白藜芦醇苷残留。该研究策略从根本上提高了纤维素酶法对苷元型白藜芦醇的提取效率,可推广应用于其他易糖苷化的中草药成分的提取。