基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究

CRISPR/Cas9是一种重要的基因组定向编辑技术,近年来在植物基因组的定向敲除和分子育种材料创制中得到了广泛应用。为了发掘可用于分子育种的低烟碱烟草,以烤烟品种K326为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制烟草烟碱合成和转运的5个基因（PMT1、QPT1、A622、NtNUP1和JAT1）进行定向敲除,并对T2代纯合基因型烟草植株进行烟碱含量检测。结果表明,定向敲除5个基因后获得100株成功编辑的T0代烟草植株,突变检出率为29.9%,突变类型以单碱基插入或删除为主。对定向敲除烟碱合成基因QPT1和转运基因JAT1的T1代纯合基因型烟草植株进行序列分析,发现存在4种突变类型,分别是插入一个T、C、A碱基的插入突变和一个缺失44个碱基的缺失突变,从而引发移码使得翻译的氨基酸链大幅缩短,其T2代植株上部叶烟碱含量显著低于野生型植株。综上所述,CRISPR/Cas9技术能够高效定向敲除烟碱关键基因,为低烟碱烟草分子育种提供了理论和技术支撑。     

烟叶落黄过程中烟碱代谢规律及相关基因表达分析

为探究烟草叶片落黄衰老过程中生物碱组分变化及代谢相关基因表达情况,以红花大金元为材料,气相色谱-质谱联用法测定中部烟叶生物碱含量,利用已有的烟草叶片衰老转录组数据(RNA-seq),分析叶片衰老成熟期烟碱代谢相关基因的表达水平,同时实时荧光定量PCR验证基因表达。结果显示,烟草进入成熟衰老期,叶片中烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明等生物碱含量逐渐升高,烟碱转运蛋白基因JAT1、NUP1,烟碱转化基因CYP82E2、CYP82E4,烟碱合成基因ADC1、ODC2、BBL2以及烟碱代谢调控基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3呈现上调表达,而调控基因MTHFR1下调表达。差异表达基因协同调控烟碱代谢过程,影响衰老叶片中的烟碱合成与积累。     

外源EBR对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响

为探明外源2, 4-表油菜素内酯（2, 4-epibrassinolide,EBR）对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响,以清水为对照,比较了烤烟打顶后叶面喷施和灌根两种EBR施用方式下成熟期叶片光合特性、干物质积累、氮代谢相关酶活性、烟碱代谢相关基因表达量和烤后烟叶化学成分的差异。结果表明,与对照相比,叶面喷施和灌根两种EBR施用方式均可提升成熟期烟株的光合能力,增加烟株各部位的干物质积累量,显著提升中部和上部烤后烟叶总氮和烟碱含量（质量分数）,且叶面喷施处理的效果好于灌根处理。两种施用方式上部叶氮素吸收同化关键酶NR和GS活性显著高于对照处理,叶面喷施处理叶片中氮同化相关基因NtGS2、NtGDH1和NtNR的相对表达量显著高于对照和灌根处理。两种EBR施用方式烟株不同部位烟碱合成基因NtQPT、NtPMT和转运基因NtJAT1、NtJAT2和NtNUP1的相对表达量均极显著高于对照,且叶面喷施处理叶片中烟碱合成与转运基因的表达量均极显著高于对照和灌根处理。因此,外源EBR可促进烟株的生长发育、提高氮代谢及烟碱代谢水平,增加中部和上部烤后烟叶烟碱含量,叶面喷施的效果好于灌根。      

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

烟碱转化为去甲基烟碱的原理研究与遗传资源开发

转化是用来描述烟草合成和贮藏尼古丁过程的术语，尼古丁是烟草中存在的主要生物碱形式，在叶片衰老和烘烤过程中，尼古丁的很大比例转化成N-去甲基化合物-去甲基烟碱，转化是一种显性性状，且具有不可逆转的特性，能使植物积累去甲基烟碱达到总烟碱量的90％。转化是白肋烟的一个特殊问题，有些品种世代间转化率可高达20％。去甲基烟碱是N’-亚硝基去甲基烟碱（NNN）的前体物，N’-亚硝基去甲基烟碱（NNN）属于烟草特有亚硝胺，就烟草而言，科学家对降低去甲基烟碱的合成方面的研究有很大的兴趣。对控制转化过程基因的了解，有助于形成新的排除白肋烟中去甲基烟碱的对策，并能从分子水平上理解去甲基烟碱的生成。新的强大的基因组技术将加快农艺学重要基因的鉴定和特性描述。为鉴定转化过程的基因资源，我们利用来源于烟草衰老叶片转化特性的等位基因的cDNA文库构建了一个表达序列标签（EST）数据库，EST数据库基因微阵表达分布，提供了鉴定尼古丁转化基因的新的机会。     

2,4-表油菜素内酯对烟苗幼茎生长及相关基因表达的影响

为研究油菜素内酯（Brassinolide,BR）对烟草主茎生长的影响,利用外源2,4-表油菜素内酯（2,4-Epibrassinolide,EBR）,设置0.5×10^-7 mol/L（T1）、0.5×10^-5mol/L（T2）两个浓度,以蒸馏水（CK）为对照对烟草幼苗进行喷施。分析了不同处理的烟草幼苗株高,节距及解剖结构特征,检测了茎中与细胞分裂和细胞大小调控相关基因以及与油菜素内酯（BR）、生长素（IAA）和赤霉素（GA）合成相关基因的表达量。结果表明,喷施EBR对烟草幼苗节距和株高有显著促进作用,并随处理浓度升高,促进作用增强。观察石蜡切片发现EBR处理后茎皮层薄壁细胞数目增多,单细胞面积减小。EBR处理后,细胞周期调控基因NtCYCD3表达上调,细胞大小调控基因NtARF6、NtARF16表达下调;BR信号受体基因NtBRI1,NtBIN2表达上调,BR转录因子NtBES1T表达下调;BR、IAA和GA的关键生物合成基因NtDWF4、NtYUCCA8、NtGA3ox-2表达量均上调。说明喷施EBR可促进内源BR、IAA和GA的合成基因表达,通过促进节间细胞分裂、抑制细胞大小促进烟草幼苗茎的生长。     

NtPHGPx基因过表达和敲除对烟草苗期耐盐性的影响

为研究NtPHGPx基因对烟草耐盐性的影响,通过转基因技术获得NtPHGPx基因过表达和CRISPR/Cas9敲除材料,利用150 mmol/L NaCl对转基因材料处理14 d,研究盐处理下转基因材料根长、GPx酶活性、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量的变化。结果表明,NtPHGPx基因表达在盐胁迫3 h后即受到诱导;盐处理显著抑制了野生型烟草根部的生长,提高了丙二醛和过氧化氢的积累;盐胁迫下过表达株系的根长比野生型更长,MDA和H₂O₂含量较低,而基因敲除材料根的生长则进一步受到抑制,GPx酶活性明显降低,地上部MDA和H₂O₂的积累显著高于野生型。综上所述,过表达NtPHGPx基因提高了烟草的耐盐性,而敲除NtPHGPx基因则减弱了烟草的耐盐性,推测NtPHGPx基因可能通过影响烟草体内活性氧物质的清除活性参与植株对盐害的胁迫响应。     

6个烟草重要产量相关性状的遗传分析

  目的  探索和分析烟草重要产量相关性状的遗传规律,为深入研究其遗传机制及烟草新品种选育过程中重要产量相关性状的选择提供依据。  方法  以烤烟Y3（P₁）和K326（P₂）为亲本配制杂交组合,在2年2点4个环境条件下利用主基因+多基因混合遗传模型方法对该组合各单世代（P₁、P₂、F₇和F₈）的株高、叶数、节距、茎围、腰叶长和腰叶宽进行遗传及相关分析。  结果  （1）在4个环境条件下,株高分别与叶数、节距间呈极显著正相关,腰叶长与腰叶宽两者间也呈极显著正相关,而节距与叶数间则呈现极显著负相关,且上述性状间的平均相关系数范围为-0.687~0.832。（2）最优遗传模型对于株高、叶数和节距3个性状均符合2对加性-上位性主基因+加性-上位性多基因混合遗传模型（MX2-AI-AI）,其主基因遗传率分别为94.304%、95.632%和91.532%,多基因遗传率分别为3.965%、0和5.489%;腰叶长和腰叶宽2性状均是受2对抑制作用主基因+加性多基因（MX2-IE-A）控制,其主基因遗传率分别为88.383%和90.166%,多基因遗传率分别为7.348%和8.807%;茎围则由3对加性-上位性主基因（3MG-AI）控制,其主基因遗传率为72.051%。  结论  上述性状在多个环境条件下主要受主基因+多基因混合遗传模型控制（除茎围外）,主基因遗传率远大于多基因遗传率,受环境影响较小,且以主基因遗传为主。故此,在烟草育种过程中针对产量相关性状的定向选择宜在早期世代进行。      

烟碱与苯甲酸的相互作用研究

  目的  探究烟碱与苯甲酸是否可结合形成稳定的复合物。  方法  通过Job’s Plot方法、核磁共振氢谱（1H NMR）、红外光谱、等温滴定量热法（ITC）以及理论计算确定了两者间的相互作用方式。  结果  （1）通过Job’s Plot方法测定了烟碱与苯甲酸的结合比例为1 : 1。（2）通过核磁共振氢谱及红外光谱确定了烟碱与苯甲酸之间存在相互作用力,确定了两者的结合方式。（3）运用等温滴定量热法再次验证了烟碱与苯甲酸的结合比例,测定了两者结合过程中的热力学数据（ΔH= -26.8 KJ/mol;ΔG= -33.99 KJ/mol;ΔS=24.12 J/mol·K）及结合常数（Ka=9.021×105 M-1）。（4）通过理论计算得出两者的结合能E=-18.64 Kcal/mol。  结论  烟碱与苯甲酸之间存在较强的结合力,可以结合形成1 : 1的复合物,结合过程是自发的放热过程,复合物拥有更高的热解温度。      

基于不同烟碱转化株鉴别标准的白肋烟品种改良效果

在采用不同烟碱转化株鉴别标准对TN86进行改良的基础上,对不同改良种的烟叶经济性状、烟碱转化率和TSNAs含量进行比较分析,以探讨采用不同转化株鉴别标准进行白肋烟品种改良的效果。结果表明,以烟碱转化率低于2.5%作为选择标准得到的改良种1（PNC<2.5）烟碱转化率稳定,上部叶比常规种低37.7%,中部叶低38.3%;总TSNAs含量低,比常规种低17.9%;产量、产值及上中等烟比例也明显优于其他改良种,且后代变异系数最小。改良种2（PNC<3）和改良种3（PNC<5）的烟碱转化性状分离明显,TSNAs含量较高。综合来说,烟株烟碱转化率2.5%作为区别转化株和非转化株的标准较为可靠,选择PNC<2.5的烟株进行留种或制种可以保证后代群体中出现转化株的频率最低,能够更有效地降低降烟碱含量和烟草特有亚硝胺的形成和积累,提高烟叶的香味品质。      

16个雪茄烟品种的烟碱转化率及与发酵后烟叶TSNAs含量的关系

  目的  明确不同雪茄烟品种烟碱转化率差异及与烟草特有亚硝胺(TSNAs)含量的关系。  方法  对16个雪茄烟品种的中部叶生物碱、硝酸盐和TSNAs含量进行了测定,并分析了其相关关系。  结果  1) 不同品种雪茄烟叶均存在烟碱向降烟碱的转化问题,参试的16个品种烟碱含量变化范围为1.14%~5.42%,平均为3.02%,降烟碱含量的变化范围为0.11%~1.47%,平均值0.40%,烟碱转化率范围为5.03%~53.12%,平均值为12.66%,品种间烟碱转化率的变异系数高达101.01%。2)茄衣品种的降烟碱含量和烟碱转化率平均值显著高于茄芯品种。3)不同雪茄烟品种烟叶中的TSNAs含量和组成具有显著差异,总TSNAs含量的变化范围为181.74 ng/g~7759.1 ng/g,平均为3010.98 ng/g,以NNN含量最高,且变异性最大,其平均值为1616.59 ng/g,变异系数为97.28%。4)相关分析结果显示,参试的16个品种的雪茄烟叶中降烟碱含量、烟碱转化率都与NNN和TSNAs含量呈极显著的正相关关系,NNN与降烟碱含量的相关系数为0.802。  结论  烟碱转化导致降烟碱含量增高是造成雪茄烟叶中NNN含量和总TSNAs含量增加的主要原因之一。      

烤烟烟碱含量与土壤养分的关联分析

在我国7 个主产烟省的12 县,统一栽培模式,采用描述统计、逐步回归分析和典型相关分析研究了烤烟烟碱含量与土壤养分的关系。结果显示：不同试点县的土壤养分含量差异较大,速效磷和全磷的变异最大,速效钾和全钾含量分布的均衡性也较差,pH则比较均匀。下部叶烟碱含量的变异程度相对较大。土壤养分与烟碱含量相关明显,不同部位烟叶烟碱含量与土壤养分指标的关联度显著不同。碱解氮、pH、有机质、全磷和速效磷对烟碱含量的影响较大,是影响烟叶烟碱含量的主导土壤养分因子,碱解氮的作用最显著,其次为土壤pH。碱解氮、pH、有机质对烟碱含量做正效应贡献,全磷和速效磷对烟碱积累不利。通过营养调控烟碱含量时,选择弱酸性、有机质含量适中的土壤,控制施氮,增施磷肥是中心措施。     

白肋烟烟碱含量的机械调控技术

研究了打顶后 5d机械切根 1/ 8、1/ 4对白肋烟烟碱合成、烟叶产量和产值的影响 ,结果表明 :机械切根能明显降低烟碱含量 ,其中切根 1/ 8与对照相比 ,上部叶烟碱下降 1.9个百分点 ,降幅31.33% ;中部叶烟碱下降 2 .13个百分点 ,降幅 5 1.4 5 %。切根处理对烟叶产值、产量无明显不利影响     

低烟碱品种及栽培模式对烤烟化学成分及感官质量的影响

【目的】为研究低烟碱品种结合低烟碱栽培模式对烟碱的降低效果及其他烟叶化学成分和烟叶质量的影响。【方法】在河南省许昌市,以常规品种中烟100、低烟碱品种ITB687和超低烟碱品种NC926为材料,设置当地常规栽培模式（LCCP）和低烟碱栽培模式（LNCP）进行栽培试验。【结果】（1）不同品种在LCCP下农艺性状差异较小,而LNCP模式对其生长后期影响较大,叶片长宽比增加,上部叶面积和单叶重显著下降。（2）在LCCP下3个品种的生物碱含量差异极大,NC926上部叶和中部叶调制后烟碱含量分别为0.28%、0.21%。LNCP显著降低烟叶烟碱和总生物碱含量,但低烟碱品种在LNCP下烟碱降幅相对较小,其中NC926上部叶调制后烟碱含量降低38.03%,中部叶无显著差异;高烟碱品种采用LNCP降低幅度相对较大,其中中烟100上部叶和中部叶调制后烟碱含量分别降低44.11%、30.01%。（3）在LCCP下不同品种同一部位烤后烟的还原糖、总糖、总氮含量均表现为中烟100>ITB697>NC926,LNCP下烟叶总氮含量降低,上部叶还原糖、总糖含量增加,但中部叶还原糖、总糖含量降低。（4）...     

基于非靶向代谢组学的红花大金不同生育期烟叶代谢图谱差异分析

  目的  为分析不同生育期烟草烟叶代谢图谱差异。  方法  以烟草品种红花大金元为研究对象,采集团棵期、现蕾期和成熟期烟叶样品,利用LC-QTOF/MS进行代谢指纹图谱检测,利用统计分析方法对差异代谢物进行筛选,基于Spearman相关分析计算代谢物之间的相关性系数,利用MetaboAnalyst软件进行代谢通路富集分析。  结果  （1）不同生育期烟草样品代谢图谱存在明显差异,共鉴定出245个差异代谢物,其中类黄酮、有机酸、氨基酸、核苷、生物碱、脂类等物质种类最多。（2）烟碱及其衍生物,如烟碱-1-氧代、麦斯明、假木贼碱、马钱子碱、新烟碱、2, 3'-二联吡啶,均随烟草生育期而逐渐累积,而与烟碱合成相关的前体物质,如精氨酸、亚精胺、腐胺、羟基丁酸等,均随着生育进程逐渐减少,且与烟碱含量显著负相关。（3）与次级代谢物合成相关氨基酸和有机酸等物质在团棵期或现蕾期含量较多,而在成熟期含量较低,与成熟期次级代谢物合成有关。（4）大部分类黄酮和酚酸组分在成熟期时含量较高,可以提高烟草抗病和抗逆能力。（5）相关性分析发现,烟碱含量与谷氨酸、泛酸、吡哆醛、蜜二糖、3-羟基邻氨基苯甲酸和顺式玉米素-o-葡萄糖苷等物质显著正相关,可能是调控烟叶中烟碱含量的重要标志物。  结论  基于代谢组学揭示了不同生育期烟草代谢物变化规律,为优质烟草育种及品质分析提供技术支撑。      

烤烟不同部位叶片烟碱含量与中微量元素的关联分析

采用描述统计、逐步回归和通径分析方法研究了统一栽培模式下7个主产烟省12个县的烤烟不同部位叶片烟碱含量与中微量元素的关系。结果表明:①烤烟不同部位叶片的中微量元素与烟碱含量都属中等变异强度,中微量元素中Mn在不同地区间的变异程度最大,P的变异程度最小。各部位烟叶中,下部叶烟碱含量的变异程度相对较大。②下部叶烟碱含量主要受Cu,Zn,Ca,Si和B含量的影响,直接效应顺序为:Si>Cu>Ca>Zn>B;中部叶烟碱含量主要受Cu,Fe,P,Mo和B含量的影响,直接效应顺序为:P>Fe>Cu>Mo>B;上部叶烟碱含量主要受Cu,Fe,Ca,Si和B含量的影响,直接效应顺序为:Si>Fe>Ca>Cu>B。由于中微量元素间的互作,不同部位烟叶的中微量元素对烟碱含量影响的总效应存在多种变化。通过调控中微量元素含量来实现降低烟叶烟碱的目标时,不同部位叶片调节的措施和目标应各有侧重:上部叶提高Si,Ca和Cu含量是主攻目标;中部叶降低B和Fe含量,提高Mo含量是中心措施;下部叶降低B含量,提高Zn和Cu含量是重点措施。     

2,4-D对烤烟烟碱和钾含量的影响

通过水培试验研究了打顶后烟株喷施2,4-D对烟株根中合成烟碱的关键酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)和N-甲基腐胺氧化酶(MPO)以及碳氮代谢重要转化酶(InV)和硝酸还原酶(NR)的活性及烟叶中烟碱含量和钾含量的影响。结果表明,喷施2,4-D的烟叶与对照相比InV活性降低,NR活性升高,协调了烟叶的碳氮代谢,根系活力降低,抑制烟株根中合成烟碱的3种酶活性,减少烟叶中的烟碱积累,同时提高烟叶中钾含量。2,4-D降碱增钾效果的最适宜浓度分别为20 mg/kg和30 mg/kg。     

采后烟叶碳代谢的动态变化分析

为探究采后离体烟叶内碳代谢的变化规律,以烤烟品种豫烟12号和秦烟96为供试材料,测定采后不同时段烟叶淀粉、总糖和还原糖含量变化,并对淀粉和糖代谢相关基因进行实时荧光定量PCR分析。结果表明,秦烟96采后烟叶淀粉含量显著高于豫烟12号,烟叶采后0~30 h,淀粉含量逐渐下降,总糖和还原糖含量逐渐升高,且糖含量在采后12 h后增加速率变快。秦烟96鲜烟叶中淀粉和糖代谢相关基因的表达量高于豫烟12号,而淀粉分解相关基因Ntα-amylase和Ntβ-amylase表达量低于豫烟12号。烟叶采后30 h内,淀粉合成相关基因NtAGPS1、NtAGPS3和直链淀粉合成关键基因NtGBSS1表达量逐渐下调;支链淀粉合成的相关酶基因表达量变化呈无序增降模式;淀粉分解代谢和糖代谢相关酶基因的表达量或呈先升后降趋势,或呈逐渐上升趋势。NtAGPS1和NtGBSS1表达量变化与采后烟叶中淀粉和糖含量变化相关性显著。同一生态条件下,豫烟12号和秦烟96采后烟叶淀粉和糖代谢规律存在差异,其中NtAGPS1和NtGBSS1可能是采后离体烟叶碳代谢的关键调控基因。