烟草病程相关蛋白NtPR10基因克隆与表达分析

为鉴定烟草病程相关蛋白PR10的生物学功能,从普通烟草G28中克隆得到了Nt PR10基因,基因全长483 bp,编码160个氨基酸。基因结构分析表明,该基因编码的蛋白包含病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域,具有与核酸酶活性相关的"P-Loop"结构。利用TMHMM、Signal P、Prosite Scan等软件分析发现,Nt PR10不含跨膜区,无信号肽,有胞内定位特征。采用实时荧光定量PCR分别分析了TMV诱导下该基因在抗、感品种枯斑三生和G28中的表达模式。结果表明,在TMV诱导下,Nt PR10基因在感病品种G28中显著上调表达;而在抗病品种枯斑三生中,TMV侵染后6 h,Nt PR10基因显著上调表达,第12小时至第8天显著下调表达,而后至第16天逐渐升高至侵染前水平。综合以上结果,Nt PR10应答了TMV侵染过程,并且在抗、感品种中整体呈现出相反的表达趋势,暗示了Nt PR10在TMV侵染过程中具有重要功能,为深入分析Nt PR10的抗病生物学功能奠定了基础。     

m型硫氧还蛋白对马铃薯Y病毒侵染烟草的影响

为进一步明确病毒与寄主间的相互作用关系,通过同源比对在烟草细胞中克隆到具有m型硫氧还蛋白(m-type thioredoxin)特征的基因,暂命名为Nt Trm。利用原生质体瞬时转化技术、病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)、半定量-PCR以及Northern blot检测技术研究Nt Trm的表达以及Nt Trm表达与PVY积累的关系。结果表明,在PVY接种10 d后红花大金元叶片中Nt Trm表达明显上调;在本氏烟草叶片中Nt Trm下调显著促进了PVY在烟草叶片中的积累;而在烟草原生质体中Nt Trm过量表达则会明显抑制病毒RNA的积累。初步说明烟草细胞内编码m型硫氧还蛋白的基因受PVY侵染而被诱导表达,这类基因的上调表达可能影响PVY在烟草细胞中的侵染。      

植物病毒侵染诱导寄主内质网应激反应

病毒侵染产生的大量病毒蛋白阻碍细胞转运功能,未折叠或错折叠蛋白在内质网腔蓄积导致内质网应激(ERs),诱发细胞保护信号未折叠蛋白应答(UPR),或导致细胞程序性死亡(PCD)。在明确了动物病毒诱导的ERs相关的UPR信号通路基础上,从非生物因素诱导的拟南芥ERs应答信号和植物病毒侵染引起ERs两方面,对近年的研究成果进行了概述。归纳出植物病毒侵染诱导寄主ERs,包括改变ER膜形态和激活UPR基因。分析了ERs应答信号在病毒侵染过程中的重要作用,指出病毒调控UPR通路完成侵染复制,寄主则通过PCD通路以主动消亡的方式抵御病毒。但UPR和PCD的关系尚不明晰,不同的病毒调控UPR信号的机制及信号强弱尚不明确,寻找病毒诱发寄主UPR和逃避寄主PCD建立侵染关系的关键调节子,是抗病毒研究的发展方向。     

烟草4种病毒的多重RT-PCR检测方法构建

为有效鉴定烟草的主要病毒,包括烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV),建立了一种同时检测这4种病毒的多重RT-PCR检测方法。通过人工接种4种病毒试验,发现TVBMV在混合侵染中受TMV、CMV和PVY的拮抗作用。为提高4种病毒复合侵染下TVBMV的检测灵敏度,筛选出TVBMV中表达水平最高的PIPO基因,利用该基因结合TMV、CMV和PVY的CP基因,基于保守区域设计引物,并优化引物及模板的浓度,在一个PCR反应体系中稳定扩增获得大小分别为700、452、275和235 bp的产物。该方法实现了对多种病毒的同时检测,适用于目前大部分烟区田间病毒复合侵染的监控。     

过表达和沉默NbRbcS基因对烟草主要病毒侵染的影响

为明确Rubisco酶小亚基(Rubisco small subunit,RbcS)在烟草抵抗主要病毒侵染胁迫中的作用,以本氏烟为研究材料,利用qRT-PCR、Western blot和瞬时表达体系对烟草RbcS基因在TMV、CMV和PVY侵染中的调控作用进行系统分析。结果表明,3种病毒侵染本氏烟均引起NbRbcS在mRNA水平和蛋白水平上下调,瞬时过表达NbRbcS,病毒拷贝数均显著降低。而沉默NbRbcS,TMV、CMV和PVY拷贝数分别达到阴性对照的11.12、9.57和17.76倍。对PVY引起的斑驳叶片中深绿色和浅绿色区域分别进行qRT-PCR分析发现,在浅叶区NbRbcS mRNA的表达量只有深叶区的49.10%,但PVY的拷贝数却达到了深叶区的5.18倍。以上研究表明,RbcS大量表达可增强烟草对病毒的防御能力,烟草RbcS基因可作为潜在的抗病毒基因利用。     

CMV-IB侵染诱导烟草内质网应激

病毒复制产生的大量病毒蛋白阻碍寄主细胞转运功能,未/错折叠蛋白在内质网腔蓄积导致内质网应激(ER stress)。为明确利用液泡膜复制的黄瓜花叶病毒(CMV)是否诱导寄主ER stress,在CMV-IB侵染三生烟和本氏烟体系中,通过qRT-PCR检测ER stress相关基因的转录水平,农杆菌介导ER marker(m Cherry-HDEL)瞬时转染后激光共聚焦显微观察ER形态,电镜观察细胞病理。结果显示,较PBS对照,接种CMV后12 h,ER stress相关基因的转录水平显著上调1.23~7.37倍;5~10 d ER膜微丝发生明显的重排和增生;病变细胞叶绿体降解、线粒体肿胀,且沿液泡膜的微自噬和细胞质中的巨自噬结构增多。表明CMV侵染通过激活ER stress基因和改变ER膜形态诱导寄主ER stress,寄主细胞会以细胞器降解、自噬乃至凋亡的方式抵御病毒扩展。     

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

链格孢侵染采后甜瓜病程相关蛋白基因表达及酶活性变化规律

以伽师瓜和86-1甜瓜为试材,损伤接种链格孢菌,比较两种甜瓜果皮与果肉抗病性差异。甜瓜果实接种链格孢,（7±1）℃、相对湿度85%～90%冷库贮藏,测定病斑直径,观察病斑组织显微结构,实时聚合酶链式反应比较CmGLU、CmCHT1、CmCHT2相对表达量,测定几丁质酶（chitinase,CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase,GLU）活性。结果表明：链格孢侵染两种甜瓜,伽师瓜病斑直径小于86-1甜瓜,果皮小于果肉,第30天时,86-1甜瓜果皮和果肉病斑直径是伽师瓜的1.28 倍和1.29 倍;观察病斑组织显微结构,发现伽师瓜和86-1甜瓜果皮通过细胞壁增厚抵御链格孢侵染,果肉组织细胞壁抵抗能力较弱,侵染末期果皮与果肉组织细胞壁分层、皱缩,细胞内布满菌丝体和分生孢子,部分果肉细胞解体,无法辨认细胞结构;伽师瓜CHT和GLU基因始终高于86-1甜瓜,果皮高于果肉,CmCHT1相对表达量在侵染初期至侵染中期较高,CmCHT2相对表达量在侵染中期较高,表明病原菌在侵染初期至侵染中期诱导了CHT基因的表达;CmGLU相对表达量在侵染中期至侵染末期较高,表明病原菌在侵染中期至侵染末期诱导了GLU基因的表达;链格孢侵入伽师瓜和86-1甜瓜后,果皮和果肉组织CHT和GLU活性随贮藏时间延长呈升高-降低的变化趋势,伽师瓜高于86-1甜瓜,果皮高于果肉。表明伽师瓜更强的抵御能力与CHT、GLU基因与酶活性密切相关。     

链格孢菌侵染采后甜瓜果实组织几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表达分析

以伽师瓜（抗病性强）和86-1甜瓜（抗病性一般）果实为实验材料,研究链格孢菌（Alternaria alternata）侵染后几丁质酶（chitinase,CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase,GLU）基因表达规律。甜瓜果实接种A. alternata,7?℃贮藏,测定病斑大小,荧光定量聚合酶链式反应测定CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量。结果表明：伽师瓜和86-1甜瓜接种A.?alternata,在侵染9?d时出现病斑,9～24?d病斑直径不断扩大,86-1甜瓜病斑直径大于伽师瓜,侵染24?d时86-1甜瓜病斑直径是伽师瓜的1.12?倍,伽师瓜对A.?alternata侵染的抵抗能力要强于86-1甜瓜。在侵染期间,伽师瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量显著提高,呈先升高后降低的变化趋势,伽师瓜和86-1甜瓜CmCht1、CmCht2和CmGlu相对表达量最高峰出现时间分别相差3、6、3?d,伽师瓜CmCht1、CmCht2相对表达量始终高于86-1甜瓜,CmGlu相对表达量在侵染12～24?d高于86-1甜瓜。在侵染期间CmCht1、CmCht2和CmGlu表达规律存在差异,侵染前期CmCht1、CmCht2相对表达量较高,侵染中期和后期CmGlu相对表达量较高;A.?alternata侵染前期主要诱导了CHT基因的表达,中期和后期主要诱导了GLU的基因表达,CHT和GLU的基因协同表达,起到抗病性的作用。伽师瓜抗病性强于86-1甜瓜与CHT和GLU的基因的表达密切相关。     

外源dsRNA介导的RNAi对烟草CMV侵染的抑制作用

为研究外源dsRNA介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）对烟草黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）侵染的抑制作用,选择与病毒在寄主体内胞间移动和长距离运输密切相关的移动蛋白（Movement protein, MP）基因为靶标,通过克隆CMV MP基因,结合序列分析评估设计dsRNA,以体外合成的方式制备了MP基因中一段490 bp的dsRNA。通过与CMV共接种,结合MP基因表达水平和病毒发病症状,综合评价MP dsRNA对CMV的抑制效果。结果表明,外源喷施的MP dsRNA显著降低了染病烟株中CMV基因的表达水平,有效抑制了病毒的侵染和危害,具有烟草CMV生物防治的应用潜力。     

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。      

烟草DELLA基因家族的克隆与表达模式分析

为明确烟草受逆境胁迫时DELLA基因家族的转录调节功能,通过烟草EST序列比对分析克隆了3个DELLA基因家族基因（NtDELLA1,NtDELLA2,NtDELLA3）,并对3个基因的结构和表达模式进行了分析。生物信息学分析结果表明,烟草DELLA基因全长1 700 bp左右,其编码蛋白包含DELLA蛋白的特征结构域DELLA基序和VHYNP基序,与拟南芥DELLA蛋白家族的GAI蛋白高度同源,推测烟草DELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白具有类似的功能;荧光定量PCR分析结果表明,这3个基因在烟草不同组织和关键生长发育时期表达模式类似,尤以茎中表达量最高;胁迫应答分析结果表明,烟草DELLA基因的转录对干旱、低温、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染和外源激素均表现出不同程度的响应,其中干旱、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）可抑制烟草DELLA基因的表达,而低温胁迫可诱导NtDELLA1上调表达,TMV侵染可诱导NtDELLA1和NtDELLA2的大量表达。      

高温介导N基因对TMV免疫丧失的代谢轮廓分析

高温(28℃)可引起含N基因的免疫寄主对TMV抗性丧失,导致TMV系统侵染。本研究以枯斑三生(Nicotianatabacum var.Samsun NN)烟草为研究材料,采用代谢组学方法,系统研究25℃和31℃条件下,TMV未侵染和TMV侵染12 h、24 h和48 h枯斑三生烟草的代谢差异。应用气相色谱与质谱联用(GC-MS)技术,结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)对不同温度下代谢产物的差异性进行分析。结果表明:GC-MS技术共检测到49种代谢物包括氨基酸类、糖类、有机酸类、脂肪酸类、醇类以及多胺类等。在25℃常温条件下,TMV侵染枯斑三生烟引起苹果酸、水杨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸和乙醇胺等代谢物含量上调,而在31℃高温处理N基因失活后,TMV侵染导致组织蔗糖和肌醇含量下调、葡萄糖和果糖含量上调以及伴随氨基酸类含量普遍上调。     

河南烟草主要病毒发生种类及侵染类型分析

为进一步明确河南烟区主要病毒种类及侵染类型,2020年从河南9个烟区分别采集疑似烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草蚀纹病毒(TEV)侵染的烟草样本共407份,分别利用上述4种病毒的特异性引物进行单重RT-PCR病原检测。检测结果表明,河南烟区病毒病样本的总检出率为98.28%,其中,检出率最高的是CMV为89.19%,其余依次为TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。侵染类型分为单一病毒侵染和复合病毒侵染,单一病毒侵染率为23.34%,该侵染类型中CMV所占比例最高,为16.71%;复合病毒侵染率为74.94%,复合病毒侵染类型中CMV+TMV所占比例最高,为36.86%,其次分别为CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY两种侵染类型,侵染比例均是7.62%。因此,CMV是2020年河南烟区的优势病毒,田间侵染以复合病毒侵染为主,侵染类型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY。     

壳寡糖对烟草TMV病毒的诱导抗性研究

以壳寡糖诱导烟草枯斑寄主后，调查了病班的抑制率，同时研究了壳寡糖单独处理和以病毒粒子侵染诱导的病程相关蛋白的差异，壳寡糖处理对TMV侵染有保护作用，施用壳寡糖后7d，以浓度为50ug/mL和75ug/mL对枯斑的抑制效果为好，壳寡糖在活体外对TMV粒子有钝化作用，单独施用壳寡糖可以诱导烟草产生6条耐碱性的PR，其中1条区别于TMV侵染诱导的PR。     

烟草NtHDZIV8基因在腺毛发育中的功能验证

为验证NtHDZIV8在腺毛发育过程中的功能，在红花大金元中克隆了NtHDZIV8基因并进行生物信息学分析，通过荧光定量PCR(qRT-PCR)探究了NtHDZIV8的表达模式，进一步利用亚细胞定位与病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术初步验证了NtHDZIV8基因对烟草腺毛发育的调控作用。结果表明，NtHDZIV8进化高度保守，具有典型的HD-LZ、START和SAD结构域，属于HDZIP IV家族。表达模式分析表明，NtHDZIV8在腺毛中高表达，并受植物激素NAA、GA3和MeJA的诱导。亚细胞定位结果显示NtHDZIV8定位于细胞核。病毒诱导本氏烟中NbHDZIV8基因沉默导致长柄腺毛的柄细胞基部膨大，而不影响短柄腺毛形态和腺毛密度。该研究表明NbHDZIV8对烟草腺毛形态具有调控作用，为解析烟草腺毛发生发育调控机制奠定了理论基础。     

小鼠PKM1基因慢病毒过表达载体的构建和稳定转染C2C12细胞株的筛选及其对糖酵解的影响

本研究旨在构建含小鼠PKM1基因的慢病毒过表达载体,筛选稳定过表达PKM1的C₂C₁₂细胞株,初步检测PKM1对细胞糖酵解的影响。提取小鼠背最长肌总RNA并反转录合成cDNA。用"Golden Gate"法构建带FLAG标签的PKM1表达载体并转染293T细胞,进行慢病毒包装并检测慢病毒滴度。转染C₂C₁₂细胞并优化转染条件,根据载体携带的抗性基因puro,用嘌呤霉素筛选稳转株。通过qPCR和Western Blot从转录水平和翻译水平检测目的基因的表达。通过测定细胞培养基的pH、乳酸含量以及葡萄消耗量检测PKM1对糖酵解的影响。结果表明小鼠PKM1基因慢病毒载体构建成功,慢病毒滴度为3.4×108 TU/mL。慢病毒侵染靶细胞的最佳感染复数为30,筛选稳转细胞株所用嘌呤霉素的最佳浓度为1.2 μg/mL。显微镜下观察病毒转导效果良好,荧光率达80%以上。过表达组中FLAG-PKM1的mRNA表达量约是空载体组的9.4万倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主细胞内表达。与野生型组和空载体组相比,过表达组细胞培养基的乳酸含量增加,葡萄糖消耗量增加,pH降低,表明细胞糖酵解加剧。本研究成功构建了含小鼠PKM1基因的稳转株,为深入研究PKM1翻译后修饰对其自身酶活以及细胞糖酵解的影响提供了材料。     

太平洋牡蛎中类FUT10蛋白的原核表达及免疫印迹鉴定

目的 原核表达牡蛎类FUT10(Fucosyl-transferase 10)蛋白并探究与人FUT10的免疫相似性。方法 本研究基于课题组前期克隆完整的类FUT10基因cDNA, 依照大肠杆菌表达蛋白的密码子偏爱性, 利用DNAMAN软件对类FUT10基因开放阅读框序列进行优化并合成, 亚克隆至载体pET-28a(+), 得到重构质粒pET-OFu3, 转入大肠杆菌BL21(DE3), 通过异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获取目的蛋白, 进行蛋白质印迹法(Western blot)鉴定。结果 在37 ℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4 h后, 出现蛋白分子量大小约为55 kDa的条带。该蛋白条带与抗6×His(组氨酸)标签抗体、抗人FUT10抗体均能发生特异性结合。结论 优化后的类FUT10蛋白与人体转移酶FUT10具有相似的免疫原性, 类FUT10蛋白的可溶性表达为探究太平洋牡蛎体内Ⅱ型血型抗原合成路径提供研究基础, 进一步探索了牡蛎体内特异性结合诺如病毒的分子机理。     

马铃薯多酚氧化酶新成员StuPPO9基因的分离鉴定及其过表达烟草遗传转化

多酚氧化酶是普遍存在于植物、动物、细菌及真菌中的一类由核基因编码的具有氧化酚类底物成醌类作用的金属铜蛋白酶,也是褐变过程中的关键酶类。本研究通过对马铃薯基因组数据库检索,发现马铃薯多酚氧化酶包含StuPPO1到StuPPO9中9个基因成员,其中StuPPO5-9为预测基因。同时StuPPO9是生物和非生物因素诱导表达的基因,然而其序列和功能未被验证。本试验以“大西洋”马铃薯叶片为试材,分别提取总RNA和gDNA,对该基因进行分离鉴定,同时对其进行过表达载体构建和转基因烟草转化,为后续基因功能验证提供技术支持。试验结果表明,StuPPO9基因大小为1884 bp,与XM_006347021一致性为98.4%,该基因含有一个内含子结构,与其他成员不同,它位于2号染色体上。该基因启动子可能被生物和非生物因素诱导激活。利用农杆菌介导的基因过表达技术,将该基因转入烟草中,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测获得了阳性株系。