烟草基因组知识篇：2．基因组测序

基因组计划的最终目标是获取所研究生物体的全部DNA序列,一般包括三个图谱,即遗传图谱、物理图谱和基因组全序列图谱,并将基因以及其他有意义的特征定位于DNA序列中.人以及模式生物的染色体都不能直接进行DNA测序,因此首先必须将它们随机地"敲碎"(通过限制性内切酶酶切或超声波处理或DNA酶Ⅰ降解)变成成千上万的小片段,构建成不同水平和类型的基因组文库,例如YAC(yeast artificial chromosome,酵母人工染色体)文库、BAC(bacterial artificial chromosome,细菌人工染色体)文库和cDNA文库等.然后对文库中的每个克隆片段进行DNA测序,再对所有测定的每条序列经过计算机程序处理装配成染色体上完整的DNA序列.     

基于EST序列的烟草cSNP发掘

SNP标记是一类应用广泛的第三代分子标记。从GenBank下载普通烟草EST序列共计317 175条,用CAP3软件对序列进行拼接。设定SNP位点的冗余度大于2,采用AutoSNP软件检测cSNP。结合位点所在序列的文库和品种信息以及多个SNP位点的共分离分值来评价其可信度。结果表明,317 175条普通烟草EST拼接成重叠群中15 429个重叠群至少包含4个读长,鉴定出53 477个冗余度大于2的候选SNP,烟草中出现SNP的频率为0.34%。其中SNP的转换率大于颠换,插入/删除表现出A/T偏好。这些高质量SNP标记的发掘为开展烟草基因功能研究和分子育种奠定了良好的基础。     

基于网络公开测序数据的K326烟草线粒体基因组RNA编辑位点的鉴定与分析

为探索RNA编辑位点在烟草线粒体中的分布和功能,通过分析烟草根、花、叶的基因组及转录组测序数据,鉴定了烟草线粒体中从胞嘧啶(C)转换为尿嘧啶(U)的RNA编辑位点.结果显示,在烟草线粒体上共发现了4212个RNA编辑位点,其中30.2％的RNA编辑位点位于蛋白编码基因(rps3、mat-R和ccmFN为RNA编辑位点最...     

烤烟烟碱含量的全基因组关联分析

烟碱是烟草属特有的一类生物碱,为加深对烟碱遗传调控机制的解析,充分挖掘高烟碱优异等位。本研究选取219份烤烟品种开展了RAD重测序研究,获得了384,904个高质量SNP位点的群体分型数据。同时在四川西昌和山东诸城2个试验点,于2012-2015年相同栽培管理条件下对供试品种的烟叶烟碱含量进行了表型鉴定。利用全基因组关联分析的策略,共发掘到2个与烟碱含量显著关联的SNP位点,分别位于1号染色体的69,912,063bp处和2号染色体的81,115,794bp处。基于上述SNP位点预测到2个候选基因,并将目标SNP位点转化3对可通过PCR检测的功能标记。通过以上研究,加深了烟碱遗传调控机制的解析,为高烟碱优异等位基因型的发掘和高烟碱新品种的分子标记辅助选择提供了可用的标记和基因资源。      

烤烟品种中川208特异性指纹图谱的构建及分析

烤烟品种中川208是经杂交选育而成的雄性不育一代杂交种,目前主要在华中和西南地区推广种植。为了加强对烟草品种的保护和利用,本研究利用中川208及其双亲的重测序数据进行SNP鉴定,并以5161份种质资源的重测序数据为遗传背景,对SNP位点进行筛选,构建了中川208的特异性指纹图谱。结果表明,该指纹图谱由285个SNP位点构成,经可靠性检验和实际测序验证,该指纹图谱对测序错误和位点缺失的容忍度极高,在兼顾可靠性和成本的条件下,可利用2X或3X的WGS测序对待测样品进行测序和检验。综上,本研究构建的烤烟品种中川208特异性指纹图谱,可靠性高,实用性强,为中川208的推广与保护提供了技术支撑,同时为烟草杂交种特异性指纹图谱的构建提供了方法参考。     

枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶Ala263位点突变对其活性的影响

研究通过对枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶celA进行三级结构模拟分析,发现其263位丙氨酸残基与底物纤维三糖间存在一定的作用;利用定点突变技术celA 263丙氨酸残基位点进行了不同的替换.结果显示野生酶的263位点丙氨酸(A263)突变为酪氨酸(A263Y)、异亮氨酸(A263I)、丝氨酸(A263S)和缬氨酸(A263V)后,其水解圈活性和CMC活力均大幅下降;DNS法测定的CMC活力分别由野生型的133.0U/L下降为A263Y 13.7U/L,A263I 36.1U/L,A263S 29.8U/L和A263V 19.6U/L.通过进一步的蛋白质精细结构模拟解析发现,263丙氨酸残基位点处于该蛋白活性口袋的内表面,为底物通道的结构区域,其羰基与底物糖基吡喃环上的羟基形成了分子间氢键.该氢键的形成可能对维持底物构象,正确引导底物在活性口袋中的定位起重要作用.该研究为诠释蛋白空间结构与其催化活性的内在联系奠定了一定的理论基础.     

限制性内切酶酶切确证河豚鱼成分PCR检测结果

动植物成分的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测往往出现假阳性结果,为了有效排 除河豚鱼成分检测中出现的假阳性现象,提高检测结果的准确性,应用河豚鱼PCR检测引物进行河豚鱼成分的PCR 检测与限制性内切酶NmeA Ⅲ酶切确证实验。18 个供试样品中3 个样品无PCR扩增产物,判为阴性结果,15 个样品 初步判为疑似阳性。应用限制性内切酶NmeA Ⅲ对疑似阳性样品的PCR产物进行酶切与电泳分析,电泳图谱与河豚 鱼阳性对照不同的2 个样品,判定为假阳性结果,电泳图谱与阳性对照相同的4 个未知学名的河豚鱼加工样品,确 证为阳性结果,即检出河豚鱼成分,PCR产物序列经GenBank同源性序列查询比对（BLAST）予以验证,建立了简 便的河豚鱼成分PCR检测结果确证方法。     

湖北地区烟草青枯菌系统发育分析

本研究采用青枯菌演化型分类框架,对来源于湖北烟区的48个烟草青枯菌进行系统发育学分析并进行序列变种鉴定,以明确该地区烟草青枯菌的菌系分化。基于青枯菌内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA蛋白修复基因(mutS)的系统发育学分析结果表明,48个供试菌株属于青枯菌亚洲分支(演化型Ⅰ)的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,未发现我国已报道的烟草青枯菌序列变种34。其中序列变种17和44为优势菌系,且均来源于恩施地区;序列变种15只包含来源于十堰地区的3个菌株。本研究表明湖北地区烟草上的青枯菌存在一定程度的遗传分化。     

小龙虾(Procambarus clarkii)加工前后优势腐败菌的分离与鉴定

以原料小龙虾和卤制加工后的即食小龙虾为对象研究其优势腐败菌种类,为后续研发适宜的杀菌工艺提供理论依据。采用传统平板分离法,从原料小龙虾与开始腐败的即食小龙虾中分别分离出优势腐败菌,通过菌落形态观察、革兰氏染色镜检对微生物种类进行初步分类。采用16S rDNA PCR扩增、限制性内切酶酶切分析以及测序的方法,进行了菌种鉴定试验。结果表明,原料小龙虾优势腐败菌为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、溶酪巨球菌(Macrococcus caseolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)、微小杆菌(Exiguobacterium indicum)和芽胞杆菌属(Bacillus spp.);即食小龙虾优势腐败菌仅检测到以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)为代表的芽孢杆菌,而其他类型的细菌在卤制加工过程中已被灭活。小龙虾加工前后优势腐败菌鉴定结果对比分析可知,高温卤制工艺难以除灭原料小龙虾中的芽孢杆菌,芽孢杆菌仍存活导致即食小龙虾腐败。     

基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉

通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11 个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8 对特异性引物,构建出2 个三重和1 个二重实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明：该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3 个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度（melting temperature,Tm）范围分别为反应体系A：73.1～75.2、76.0～77.3、79.0～80.0 ℃,反应体系B：69.5～72.8、75.0～77.9、78.5～80.0 ℃,反应体系C：76.1～78.1、79.5～80.7 ℃;根据3 个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。     

不同Cd积累基因型烟草中Cd的亚细胞分布及化学形态

采用苗期水培试验,以Cd积累模式不同的两个烟草基因型普通烟草品种K326(根系和叶片积累)和黄花烟草品种N.rustica(根系积累)为试材,比较了不同Cd浓度下(1 μmol/L和50 μmol/L)两个基因型烟草根系和叶片中Cd的亚细胞分布和化学赋存形态.结果表明:①Cd浓度1μmol/L时,K326表现为根系和叶片积累,N.rustica以根系积累为主;高Cd浓度下两者均显示根系积累特性.②Cd浓度1 μmol/L时,K326和N.rustica中Cd主要结合于可溶组分中,且两个基因型烟草中Cd在可溶组分中的积累比例高低与相应部位Cd积累总量大小相一致.表明Cd在可溶组分中截留比例可能是造成普通烟草和黄花烟草Cd积累特征不同的影响因素之一.③两个基因型烟草根系中Cd以乙醇提取态为主,叶片中Cd主要以氯化钠结合态和去离子水结合态存在.提高Cd处理浓度,Cd存在由活性强的化学形态向活性弱的形态转化的趋势.但在两基因型烟草中Cd的化学形态没有明显的的种间差异,表明两基因型烟草对Cd积累的差异与其化学赋存形态关系不大.     

我国烟草种质资源的种类与分布概况

种质资源是作物育种和人类生产的物质基础.笔者阐述了我国烟草种质资源的种类及其分布,详细介绍了野生烟、烤烟、晒晾烟、香料烟、白肋烟、雪茄烟和黄花烟的保存数量和种质特点,并对我国各类烟草种质资源的分布进行了比较和分析,旨在为我国烟草种质资源的进一步收集、保存及更好的利用提供理论和应用基础.     

纳米碳用量对烤烟生长发育和钾素吸收积累的影响

为明确纳米碳在烤烟生长和钾素吸收利用上的应用效果,在盆栽条件下,研究了纳米碳不同用量对烤烟根系生物量、干物质积累和钾素吸收积累的影响.结果表明,在常规肥料中添加纳米碳促进了烤烟植株生长发育,有利于烟株的早发和快长,与对照相比,纳米碳用量为肥料总重量的0.1％,0.3％和0.5％的处理烤烟单株干物质积累量分别增加4.08...     

水分胁迫对烤烟生理特性和光谱特征的影响

为明确烤烟在不同水分条件下的生理生态响应,通过盆栽试验研究了水分胁迫和复水对烤烟生理特性和光谱特征的影响。结果表明:干旱胁迫下烤烟叶片叶绿素和可溶性蛋白质发生降解,光合速率和蒸腾速率下降,导致干物质积累量降低;干旱胁迫后复水叶片光合速率和蒸腾速率有所回升,表现出一定的补偿效应。渍水胁迫亦严重影响烤烟叶片生理功能,造成叶片膜质过氧化程度加重,其危害程度甚至大于干旱胁迫。干旱和渍水胁迫均提高了可见光460～670 nm范围内的植株光谱反射率,而降低了近红外780～1050 nm范围内的光谱反射率。因此,光谱特征可作为诊断烤烟水分胁迫程度的重要手段。     

基于RAD-seq数据开发烟草多态性SSR标记

采用RAD-seq技术对两份烟草材料"118-3"和"粤烟98"进行简化基因组测序,分别获得45 119 346和50 360 738个高质量干净读长（HQ clean reads）。通过序列分析,在22 145个reads覆盖的参考基因组序列中共检测到25 343个SSR位点,其中以二和三核苷酸重复基序最为丰富,占总SSR位点的71.59%;除单核苷酸类型外,SSR基序的重复次数主要集中在4~9之间。根据SSR位点两翼的序列,利用Primer 3.0成功设计出23 346对SSR引物,引物设计的成功率为92.12%。依据测序数据初步发现这些SSR中有323个（1.38%）SSR在两份测序材料间具有多态性,随机选择其中50个SSR在4份烟草材料中进行验证,结果发现在两份测序材料间的多态率为76%,存在24%的假阳性;在另两份烟草材料中多态率为20%。研究结果表明,利用简化基因组测序技术能够开发大量SSR标记和发现样品间具有多态性的SSR标记,可为SSR标记的开发和应用提供基础。     

开发TRAP标记的新策略

烟草作为重要的经济作物和生物工程研究领域的模式植物,由于基因组庞大、结构复杂、重复序列较多以及缺少理想的分子标记,致使大量重要农艺、品质性状缺少分子水平上的遗传研究.因此开发适合烟草的分子标记对其遗传研究具有重要意义.本研究在以往TRAP标记开发经验的基础上,探索了一种直接利用EST-SSR引物作为固定引物开发TRAP标记的新方法,降低了TRAP标记的开发难度和成本,在短期内能开发出丰富的TRAP标记组合.本研究开发了首套烟草TRAP标记,结果显示其扩增带型理想,多态性较高,并在普通烟草品种中筛选到一条类香料烟特殊高香气基因型特征带,显示出良好的应用前景.     

烟草抗番茄斑萎病毒基因筛选与生物信息学分析

通过同源克隆的方法在TSWV高感烟草品种NC89、TSWV耐病烟草品种中烟100中分别克隆出一个疑似抗番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)的基因,分别命名为NtSw-5^NC89和NtSw-5^zy100。序列分析表明,NtSw-5^NC89长3819bp,包含1个完整的读码框,编码1273个氨基酸,理论等电点和相对分子质量分别为5.64和147529.5Da;NtSw-5^zy100长3165bp,包含1个完整的读码框,编码1054个氨基酸,理论等电点和相对分子质量分别为6.75和122032.9Da;NtSw-5^NC89和NtSw-5^zy100均不含信号肽,均无明显跨膜区,二者均含有大多数植物抗性蛋白所共有的CC-(NB-ARC)-LRR典型结构。系统进化树分析表明,NtSw-5^NC89与马铃薯假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3近源关系最近,NtSw-5^zy100与烟草假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3同型X2近源关系最近。该结果可为烟草番茄斑萎病毒抗性研究和烟草番茄斑萎病毒的防治提供理论基础。     

普通烟草品种生长发育过程中叶表腺毛密度及其形态的比较

以6个普通烟草品种为试验材料,比较了烤烟、白肋烟、晒烟和晾烟品种间及同一品种的不同发育时期烟草叶表不同部位腺毛形态、密度的差异.结果表明:几种供试烟草品种在生长发育过程中的腺毛类型主要有长柄腺毛、短柄腺毛和无头腺毛,但在烟草整个发育过程中始终以长柄腺毛为主.从烟草现蕾期开始,部分长柄腺毛的头部开始萎缩、脱落,形成无头腺毛.几种供试烟草品种从移栽期开始腺毛密度逐渐增加,到现蕾期腺毛密度达到最大值,成熟期又明显下降.烟草叶片上表面的腺毛密度均大于下表面,但叶尖、叶中部和叶基部的腺毛密度没有明显差异.     

2,4-表油菜素内酯对烟苗幼茎生长及相关基因表达的影响

为研究油菜素内酯（Brassinolide,BR）对烟草主茎生长的影响,利用外源2,4-表油菜素内酯（2,4-Epibrassinolide,EBR）,设置0.5×10^-7 mol/L（T1）、0.5×10^-5mol/L（T2）两个浓度,以蒸馏水（CK）为对照对烟草幼苗进行喷施。分析了不同处理的烟草幼苗株高,节距及解剖结构特征,检测了茎中与细胞分裂和细胞大小调控相关基因以及与油菜素内酯（BR）、生长素（IAA）和赤霉素（GA）合成相关基因的表达量。结果表明,喷施EBR对烟草幼苗节距和株高有显著促进作用,并随处理浓度升高,促进作用增强。观察石蜡切片发现EBR处理后茎皮层薄壁细胞数目增多,单细胞面积减小。EBR处理后,细胞周期调控基因NtCYCD3表达上调,细胞大小调控基因NtARF6、NtARF16表达下调;BR信号受体基因NtBRI1,NtBIN2表达上调,BR转录因子NtBES1T表达下调;BR、IAA和GA的关键生物合成基因NtDWF4、NtYUCCA8、NtGA3ox-2表达量均上调。说明喷施EBR可促进内源BR、IAA和GA的合成基因表达,通过促进节间细胞分裂、抑制细胞大小促进烟草幼苗茎的生长。     

水分胁迫对烤烟氨同化和生物量的影响

为明确不同水分条件下烤烟氨同化和氮素代谢差异,在盆栽条件下,研究了干旱和渍水胁迫对烤烟氨同化关键酶活性和生长发育的影响.结果表明,干旱胁迫下烤烟叶片GS和GOGAT活性下降,GS/GOGAT循环受阻,而NADH-GDH活性明显上升,在氨同化中的作用加强;干旱胁迫严重影响烤烟植株正常生长发育,降低生物量,这可能是导致叶片氮素含量相对增加的重要原因.干旱胁迫后复水烤烟GS活性迅速回升,脯氨酸含量恢复到正常水平,体现了复水对烟株的补偿效应.严重的渍水胁迫导致烤烟植株生理功能紊乱,氨同化关键酶活性和氮索含量均显著下降,植株生物量降低,是烤烟生产不可忽视的逆境条件.