基于酸处理的产志贺毒素大肠埃希菌选择性增菌方法研究

目的开发一套基于酸处理的产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)选择性增菌方法,提高食品中STEC菌株的检出率。方法 选择12株不同血清型STEC菌株以及13株常见干扰菌,评价其对不同酸处理条件(pH2.0、2.5、3.0)的耐受性;考察筛选的酸处理条件对营养胁迫和冷冻胁迫状态STEC菌株生长活性的影响;比较研究酸水解酪蛋白、酵母提取物和丙酮酸钠等成分对胁迫状态STEC菌株的促生长作用,优化酸处理后中和/促生长培养基配方;比较增菌前与增菌后两种酸处理方式对STEC菌株分离效果的影响;最后通过人工污染样品,评价本研究建立的STEC酸处理选择性增菌方法的检测效果。结果 本研究建立了一种不依赖于抑菌成分的STEC选择性增菌方法,样品在增菌前经酸处理培养基室温处理2 h,降低背景杂菌干扰,再通过中和/促生长培养基(TSB-1.5%Tris-0.1%丙酮酸钠)进行目标菌的增菌培养;人工污染试验结果表明,本方法与我国现行GB4789.36-2016标准方法相比,能够有效减少背景杂菌的干扰、获得更高的STEC分离效率。结论 本研究建立的基于酸处理的STEC选择性增菌方法能够有效提高食品中STEC菌株的检测效率和检测准确性。     

建立一种快速检测坂歧肠杆菌的方法

目的:建立快速检测婴儿配方奶制品(IFM)中坂歧肠杆菌的方法。方法:选择ATCC坂歧肠杆菌标准株,对不同的增菌性培养基、选择性培养基和显色培养基进行研究;结合VITEK仪和API20E细菌鉴定系统,构建快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法。结果:建立的快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法,所需检验流程为72h,方法灵敏度为2CUF/g,能有效区别于阴沟杆菌、产气杆菌等肠杆菌科细菌;方法应用稳定;操作简单、方法可靠,适宜规模化检测。结论:本研究认为,所建立的快速检测配方奶制品中坂歧肠杆菌的方法适宜检验检疫的工作要求,能有效地发现配方奶制品中坂歧肠杆菌的污染情况。     

腐败发酵蔬菜中产膜醭细菌的分离鉴定及其生长特性分析

以发酵蔬菜为研究对象,分离和鉴定其中形成腐败膜醭的主要微生物,并分析其生长特性。利用胰蛋白胨大豆琼脂培养基分离培养发酵蔬菜腐败膜醭中的微生物,挑取50株单克隆回接到发酵盐卤胰蛋白胨培养基中培养,将能够在培养液表面显著形成膜醭的菌株进行16S rDNA或18S rDNA分子生物学鉴定。结果表明这6株菌均为细菌,分别为枯草芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、科氏葡萄球菌科氏亚种、普罗威登斯菌、克雷伯氏杆菌属和阴沟肠杆菌。利用5种发酵蔬菜模拟培养基培养上述6株细菌,发现不同菌株在不同培养基中产膜醭情况不同。枯草芽孢杆菌和科氏葡萄球菌科氏亚种除了能形成膜醭外,还能引起培养基pH值升高,并对氮源需求不高。克雷伯氏杆菌属和普罗威登斯菌仅在发酵盐卤胰蛋白胨培养基和发酵蔬菜汁胰蛋白胨培养基中形成膜醭。上述细菌可能是发酵蔬菜腐败膜醭形成的关键细菌和潜在威胁。     

1种选择性富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培养基SSSV研究

设计并制备1种同时富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的复合共增菌培养基SSSV,用于水产品中上述常见4种食源性致病菌的快速增菌。以缓冲蛋白胨水为基础培养基,挑选适合的促进剂、抑制剂及营养物质等做单因素试验和正交试验,确定其最佳成分及配比;分析SSSV培养基对目标菌的生长选择性以及混合菌的生长特性;通过人工污染试验,评价SSSV对不同贮藏条件下的水产品中目标致病菌的增菌复原能力。结果表明,共增菌培养基SSSV对非目标菌表现一定的抑制作用,对4种致病菌的增菌效果优于营养肉汤,但略差于国家标准中目标菌各自的选择培养基。SSSV能同时富集不同接种比例组成的混合菌,37℃培养8h后,菌体浓度均在104～104CFU/mL范围。SSSV能有效修复冷藏和冻藏水产品中冷受伤的目标致病菌。人工污染102CFU/mL目标菌的冷藏和冷冻虾仁、目鱼卷及鱼丸样品,经SSSV培养基在37℃分别培养8h和12h,可使菌体浓度在105～106CFU/mL。可见,SSSV培养基可应用于水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌检验的前增菌,可望与多重PCR检测方法联用,以加快检测时间,提高检测率和准确性。     

显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定

研究比较沙门氏菌显色培养基(CAS)上干扰菌与沙门氏菌的区别,提高沙门氏菌的分离鉴定效率。使用沙门氏菌和7株干扰菌(铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亚种、粪产碱菌亚种)分别接种CAS、BS、XLD和HE培养基,观察菌落形态特征,分析生化试验结果,考察TTB和SC选择性增菌液对7株干扰菌的选择效果。7株干扰菌在CAS培养基上都是紫色菌落,仔细辨认大部分都可与沙门氏菌区分,无法从菌落形态区分的恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌通过在BS上的生长情况或生化试验可以排除,TTB和SC选择性增菌液对7株干扰菌的选择效果各不相同,提示检测过程中TTB和SC两种增菌液须同时使用,相互补充,提高检出率。     

沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的选择性共增菌培养基的研制

目的 研制一种可同时对沙门菌、金黄色葡萄球菌及副溶血性弧菌进行富集的共增菌培养基SSV,达到同时检测3种食品中常见的食源性致病菌的目的。方法 根据3株菌的营养需求,选择不同的培养基组分进行单因素实验,确定选择性共增菌培养基的配方,通过OD600 nm、受损菌复苏、多重聚合酶链式反应(PCR)、培养基选择性4个方面对SSV培养基进行验证。结果 确定增菌培养基的成分为：蛋白胨10.0 g、KH₂PO₄ 1.5 g、NaCl 15.0 g、LiCl 1.0 g,Na₂S₂O₃ 5.0 g、去氧胆酸钠0.05 g、甘露醇1.0 g、丙酮酸钠5.0 g,蒸馏水1 000 mL。SSV培养基能同时富集以上3株菌,37℃培养16 h后,3株菌的菌体浓度均达到107 CFU/mL及以上;SSV培养基对于受损的目标菌有良好的复苏效果,复苏后OD₆₀₀ nm较于复苏前增长了3倍;同时多重PCR、培养基选择性也得到很好的验证。结论共增菌培养基SSV可用于同时培养沙门菌、金黄色葡...     

小肠结肠炎耶尔森菌前增菌方式的选择

小肠结肠炎耶尔森菌作为一种食源性致病菌逐渐引起了关注。本实验利用胰蛋白胨培养基、改良磷酸盐缓冲液和氯苯酚-替卡西林-氯酸钾培养基对小肠结肠炎耶尔森菌前增菌,并采用实时荧光PCR方法对增菌效果进行检验。结果表明：在纯菌体系中胰蛋白胨培养基对小肠结肠炎耶尔森菌的增菌作用优于其他两种培养基,并且增菌24h后即可检测到该菌。在混菌体系中小肠结肠炎耶尔森菌经过改良磷酸盐缓冲液增菌后灵敏性最高,并且增菌时间可缩短至8h。因此在实际检测中可采用改良磷酸盐缓冲液对该菌进行增菌检测。     

改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基的应用效果

评估GB 4789.11-2014《食品安全国家标准食品微生物检验β型溶血性链球菌检验》中改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基的质量。选取国内三家(标记为A、B、C)和国外一家(标记为D)培养基生产商的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(商品化脱水合成培养基)和相应添加剂,使用目标菌(乙型溶血性链球菌FSCC225016)和非目标菌(大肠埃希氏菌ATCC25922),依据GB4789.28-2013《食品安全国家标准食品微生物检验培养基和试剂的质量要求》中选择性增菌培养基的定性测试方法进行质量评估。同时不加添加剂进行试验。国内A、B和C三家改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基中目标菌浊度值均为0,非目标菌浊度值为0;未加试剂的培养基目标菌浊度值均为0,非目标菌浊度值为0。国外D改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基中目标菌浊度值为2,非目标菌浊度值为0;未加试剂的培养基目标菌浊度值为2,非目标菌浊度值为1。国内A、B、C三家的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基质量评估证明是胰蛋白胨大豆肉汤培养基(不加添加剂)基础成分的问题;国产胰蛋白胨大豆肉汤培养基质量有待提高。     

国产与进口两种商品化NBB培养基检测啤酒有害菌的效果比较

目的:比较国产和进口NBB培养基对啤酒有害菌的检测效果。方法:将干酪乳杆菌、短乳杆菌、四联球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、植物乳杆菌植物亚种6株乳酸菌接种到NBB-B和NBB-A培养基中,28℃厌氧培养24～72 h,测定OD值,观察培养基变色、菌落生长状态等。同时,用不同浓度麦芽啤酒配制NBB培养基,确定配制培养基用啤酒的最适麦芽度。结果:6株乳酸菌在国产和进口NBB-B培养基中灵敏度和指示特征无明显差异。戊糖片球菌在国产NBB-A培养基培养48 h变色情况略差于进口NBB-A,培养72 h后,与进口NBB-A培养基无差异。通过不同麦芽度比对试验,采用10°P啤酒配制的NBB培养基菌株生长情况最好。结论:国产与进口NBB培养基在灵敏度、指示能力、菌落生长等方面无明显差异,国产NBB培养基可用于国内啤酒生产企业检测啤酒有害菌。     

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单增李斯特菌选择性共增菌培养基的研制

目的:研制一种对沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella)和单增李斯特菌(Listeria monocytogens)的选择性共增菌培养基(SSSL培养基)。方法:挑选添加成分进行单因素试验,确定SSSL培养基的成分及配比,采用平板计数法验证SSSL培养基的增菌效果。结果:确立了SSSL培养基配方,目标菌在SSSL增菌培养基中培养8 h后,菌体浓度都达到了10~5～10~6CFU/m L,而且抑制非目标菌的生长。结论:SSSL培养基能用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单增李斯特菌选择性共增菌,可望与多种检测方法联用,以提高检测率和准确性。     

沙门氏菌及副溶血性弧菌的共增菌培养基的研制

为研制一种可同时富集沙门氏菌和副溶血性弧菌的增菌培养基,参照GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013规定的增菌培养基成分,并根据目标菌不同的营养需求,筛选适宜抑制剂和促进剂,进行单因素实验,确定共增菌培养基的配方,并验证该培养基的增菌效果。结果表明:研制出用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培养基成分为:蛋白胨10.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,氯化钠7.5 g,硫代硫酸钠5.0 g,牛胆盐0.1 g,柠檬酸钠2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000 mL。目标菌初始接种量为102 CFU/mL,在37 ℃下培养16 h后,两种目标菌的菌浓度可达到107~108 CFU/mL。结果表明,共增菌培养基可用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的富集培养,培养基配制简易,节约成本,具有良好的市场前景。     

Isolation of salmonellae using two forms of Rappaport-Vassiliadis medium and brilliant green agar

The relative efficiencies of Rappaport-Vassiliadis medium containing tryptone (RV medium) or soya peptone (RV-soya) were compared for the isolation of salmonellae from 518 naturally contaminated chicken livers. RV-soya (299 of 518) gave slightly better recoveries than the standard RV medium (295 of 518) although the difference was not statistically significant (P> 0.05). 60% of the samples which were found to be positive after 24 h enrichment in RV-soya were also positive after just 6 h incubation. It was shown that the use of 14 cm plates of brilliant green agar gave better Salmonella recoveries than did 9 cm plates of the same medium. However, when sulphamandelate supplement was incorporated into the medium, recoveries were further increased. We conclude that RV-soya is an effective alternative to the standard RV medium for the isolation of salmonellae from poultry and would recommend a protocol of pre-enrichment in buffered peptone water, enrichment in RV-soya for 24 h at 43°C and plating on brilliant green agar containing sulphamandelate supplement.     

Hansenula anomala转化葡萄糖生产阿拉伯糖醇的研究

对Hansenula anomala转化葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇的反应条件进行了研究。高供氧量有利于阿拉伯糖醇的生成。在一定范围内,葡萄糖初始浓度越高,阿拉伯糖醇的产量也随之明显提高。并通过正交实验,确定了最佳发酵条件为(g/L):葡萄糖500,酵母膏2,蛋白胨2,CaCl20.5,(NH4)2SO45,MgSO41,KH2PO43,pH5.0;发酵温度30℃,装液量15～20mL/500mL三角瓶,发酵时间263h。阿拉伯糖醇浓度为245.97g/L,转化率为0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖,平均反应强度0.935g/Lh。     

Evaluation of a 24-hour bioluminescent enzyme immunoassay for the rapid detection of Salmonella in chicken carcass rinses

A bioluminescent enzyme immunoassay (BEIA), using Salmonella-specific monoclonal antibody M183 for capture and biotinylated monoclonal antibody M183 for detection, was developed with InteLite AB streptavidin-biotinylated firefly luciferase complex as a reporter. Salmonella cultures were preenriched in buffered peptone water with shaking for 6 h at 37 degrees C and then selectively enriched in Muller-Kauffmann tetrathionate (MKTT) broth and modified semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) medium for 16 h at 42 degrees C. After enrichment, the total test time for the BEIA was 1.5 h. The analytical sensitivity of the BEIA ranged from 6.0 x 10(2) CFU/ml to 1.2 x 10(5) CFU/ml in MKTT and from 1.4 x 10(5) to 2.3 x 10(6) CFU/ml in MSRV using six Salmonella serovars prevalent in Canada. With enrichment cultures, the BEIA detected 1 CFU of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in 25 ml of chicken rinses. Representative strains of 10 Salmonella serovars were detected, and cross-reactivity was not observed with 25 non-Salmonella foodborne bacteria. The BEIA performance was assessed by testing 420 poultry samples, which were analyzed in parallel with the standard MSRV culture method. The BEIA detected 117 (27.88%) Salmonella-positive samples, whereas the standard MSRV culture method detected 124 (29.5%). The BEIA had a sensitivity of 64.5% and a specificity of 87.5% compared to the standard MSRV culture method. However, similar specificities and sensitivities were obtained when the standard MSRV culture method was compared to the BEIA (sensitivity = 68.4% and specificity = 85.5%). Neither method detected 100% of the Salmonella found in the samples tested, and statistical analyses indicated no significant difference between the two methods. In summary, the BEIA offers another alternative for the detection of Salmonella, with the additional advantage of providing a 24-h test for detecting Salmonella in chicken carcass rinses. The results obtained in this research indicate that tests are still needed for the isolation and detection of Salmonella that will establish the true prevalence of Salmonella in chicken samples.     

蔬菜发酵专用乳酸菌的菌体高密度培养

菌体高密度培养是制备浓缩型蔬菜发酵专用菌粉的关键。采用缓冲盐法、化学中和法和补料培养法进行乳酸菌NCU0101的菌体高密度培养,分析研究培养基配方、培养条件、补料培养方式对菌体活菌数的影响。结果表明:菌体适宜培养基配方为葡萄糖5%、蛋白胨1%、磷酸氢二钾0.5%、醋酸钠0.3%,适宜培养条件为培养液pH值6.3～5.8、培养温度30℃、振荡频率40r/min、培养时间20h,适宜补料培养方式为培养0、4和8h时各补加2.5%的碳氮源(碳氮比为5:1);培养结束后,培养液中乳酸菌菌体活菌数可达7.83×109CFU/ml。     

冷榨花生粕蛋白胨酶法制备及其在微生物增殖培养中的应用

为探讨冷榨花生粕蛋白质酶法制备蛋白胨替代商用蛋白胨的可行性,将冷榨花生粕用胃蛋白酶与碱性蛋白酶进行双酶协同水解制备冷榨花生粕蛋白水解物（也称为冷榨花生粕蛋白胨）,并分析其分子质量分布、化学组分分析及氨基酸组成。研究发现,经双酶协同水解后的冷榨花生粕蛋白胨主要由小于5.0 kDa的肽段组成,富含丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸等氨基酸,特别是谷氨酸含量较高。微生物增殖培养实验结果表明,大肠杆菌在冷榨花生粕蛋白胨培养基中培养8 h后比牛肉膏蛋白胨中生长情况好;枯草芽孢杆菌在冷榨花生粕蛋白胨培养基中比LB培养基中有较长的滞后期,但培养8 h后,生长情况比LB培养基更好;大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在冷榨花生粕蛋白胨培养基和对照培养基中pH值变化差异不显著（P＞0.05）;干酪乳杆菌在冷榨花生粕蛋白胨培养基和MRS培养基中生长情况有显著差异（P＜0.05）;金黄色葡萄球菌在冷榨花生粕培养基中与对照培养基生长差异不显著（P＞0.05）;酿酒酵母在冷榨花生粕培养基中与对照生长有类似的生长曲线与pH值变化趋势;米曲霉在冷榨花生粕培养基中与对照培养生长无显著差异（P＞0.05）。结果表明,冷榨花生粕蛋白胨在替代商用蛋白胨用于微生物的增殖培养应用中具有很好的潜力。     

直投式纳豆菌发酵剂制备工艺优化

为探索出一种工艺简便、成本低且活菌数高的直投式纳豆菌（Bacillus natto）发酵剂的制备方法,该研究以大米粉为基质替代传统的种子液培养基培养纳豆菌后直接将其烘干制成直投式纳豆菌发酵剂,通过单因素及正交试验优化直投式纳豆菌发酵剂的制备工艺。结果表明,用含1.5%蛋白胨的大米粉作为培养基,在接种量4.0%、加水量40%、培养温度43 ℃条件下培养纳豆菌28 h,菌体生长良好,将培养物烘干后制成的直投式纳豆菌发酵剂中的活菌数含量达4.71×109 CFU/g。此技术操作简便,可推广至工业生产中,简化生产过程。     

酸马奶中乳酸菌与酵母菌的共生发酵特性

对内蒙古锡盟地区酸马奶中分离出的1株乳酸菌和1株酵母菌进行混合培养,初步确定双菌混合发酵的最佳培养条件：双菌发酵计数乳酸菌活菌数的最佳发酵温度为30℃摇床培养12h再转到37℃静置培养,最佳发酵时间为20h,脱脂乳中添加的营养成分最优配方为蛋白胨1g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL;双菌发酵计数酵母菌活菌数的最佳发酵温度为37℃静置培养8h再转到30℃摇床培养,最佳发酵时间为32h,脱脂乳中添加的营养成分最优配方为蛋白胨0.5g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL;选用乳酸菌与酵母菌质量比1:1作为菌种配比。 同时在最佳生长条件下探讨乳酸菌与酵母菌的相互作用关系以及后发酵对二者共生作用的影响,结果表明,促进乳酸菌生长的活性物质生成的时间为12h以前(即将酵母菌在5号配方中30℃摇床培养),促进酵母菌生长的活性物质生成的时间应为16h以前(即将乳酸菌在1号配方中37℃静置培养),在后发酵过程中,乳酸菌与酵母菌双菌培养的活菌数都极显著高于单菌培养(P＜0.01)。     

泡菜直投式菌剂制备及应用研究

本研究采用自行分离选育的植物乳杆菌进行增菌培养,确定了植物乳杆菌的增菌最佳培养基成分为:以添加2%的葡萄糖、1%的蛋白胨为基础培养基,加入5%蕃茄汁、6%辣椒汁、7.5%莴苣汁,增菌最佳培养条件为:培养温度为30℃、振荡频率为50r/min、发酵期间pH为6的条件下,植物乳杆菌的最高活菌数达3.56×109cfu/ml,5%麦芽糊精+5%蔗糖+0.8%海藻糖+0.2%吐温作为冻干保护剂所得结果最好,植物乳杆菌菌体的冷冻存活率为83.6%、冻干存活率为80.6%、冻干菌粉活菌数为2.37×1010cfu/g。使用直投式功能菌剂发酵青菜,在30℃条件下,盐水浓度为6%￣8%,青菜发酵时间为4d,在25℃条件下,青菜发酵时间为5d,泡青菜产品具有较浓的乳酸发酵的香气,酸味纯正,滋味浓郁,酸度适中。     

乳酸菌菌粉定量计数方法研究

目的:以9株乳杆菌、6株双歧杆菌、3株球菌、1株凝结芽孢杆菌菌粉为研究对象,在国标GB 4789.35-2016的基础上,对稀释倍数、稀释液成分、培养基成分进行比较研究,考察对乳酸菌菌粉计数活菌数的影响。方法:采用稀释平板计数的方法,对不同的乳酸菌菌粉进行活菌计数。结果:初始乳酸菌菌粉样品稀释倍数对最终计数活菌数无明显影响,ISO稀释液对部分乳杆菌、双歧杆菌菌粉的活菌计数结果有显著提高(P<0.05);双歧杆菌菌粉采用TOS琼脂培养基的计数结果显著优于国标培养基(P<0.05);凝结芽孢杆菌菌粉采用改良芽孢计数培养基计数结果优于PCA和NA计数培养基。结论:平板计数方法中,稀释液中含有酪蛋白胨能提升双歧杆菌菌粉的活菌计数数量;TOS琼脂培养基更有利于双歧杆菌的增殖培养;改良芽孢计数培养基更有利于凝结芽孢杆菌的芽孢萌发增殖。