中蜂囊状幼虫病病毒依赖解旋酶扩增检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病病毒(chinese sacbrood,CSBV)依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplific ation,HDA)检测方法,并对该方法进行优化及验证。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫RNA,以其为模板进行HDA,对建立的HDA的引物浓度(原始浓度为50μmol/L,进行10、20、40、80、160、240、320倍稀释)、反应温度(60、65及70℃)及时间(60、90及120 min)进行优化,并对优化的方法进行特异性、敏感性及稳定性验证。经电镜观察、RT-PCR及优化的HDA法对37份临床样品进行检测。结果 HDA最佳引物浓度、反应温度及时间分别为5μmol/L、65℃及90 min;CSBV与健康幼虫、蜜蜂急性麻痹病毒(acute bee paralysis virus,ABPV)、蜜蜂慢性麻痹病毒(chronic bee paralysis virus,CBPV)、黑蜂王台病毒(black queen cell virus,BQCV)和残翅病毒(deformed wing virus,DWV)cDNA均无交叉反应,HDA的最低检出限为10-2ng,检测试剂保存12个月后,仍可扩增出目的条带;37份临床样品中,有6份样品的RT-PCR和HDA结果为阳性,但电镜观察仅有4份为阳性。结论建立了CSBV HDA检测方法,该方法具有较高的敏感性、特异性及稳定性,为检测其他蜂病毒及快速鉴定其他动物病毒提供了参考。     

中蜂囊状幼虫病毒VP1基因在杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒系统表达中蜂囊状幼虫病毒(chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP1基因。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫总RNA,RT-PCR法扩增VP1基因,克隆至载体pFastBacI中,构建重组转座质粒pFastBacI-VP1,转化至感受态大肠埃希菌DHl0Bac中,获得重组杆粒rBacmid-VP1,转染至昆虫细胞sf9中,获得第1代重组杆状病毒,经透射电镜观察杆状病毒粒子;病毒连续传代3次后,RT-PCR鉴定重组杆状病毒,SDS-PAGE检测VP1蛋白的表达情况,Western blot检测表达产物的反应原性。结果重组杆粒经PCR鉴定构建正确;第1代重组杆状病毒经透射电镜观察,可见杆状病毒粒子;重组杆状病毒以M13通用引物和VP1基因特异引物进行PCR扩增,分别可见3 263和963 bp的片段,大小均与理论值一致;CSBV VP1基因能够在sf9细胞中表达,表达的重组VP1蛋白相对分子质量约31 000,可与兔抗CSBV-VP1阳性血清发生特异性反应。结论成功利用杆状病毒表达系统表达了CSBV VP1基因,为深入研究CSBV的感染机制和蜜蜂的免疫机制以及中蜂囊状幼虫病血清诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备

目的原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清。方法采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达;纯化后纯度可达95%以上;制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白。结论成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。     

重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒型特异性遗传变异分析

目的分析重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的遗传多样性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV的2段结构蛋白和1段非结构蛋白的编码序列,并克隆至pMD18-T载体进行双向序列测定,所得序列在NCBI上进行BLAST搜索,以进行同源性分析;应用ClustalW2软件进行多序列比对分析;应用SNAP软件计算同义替换率(Synonymous substitution rate,dS)、非同义替换率(Nonsynon-ymous substitution rate,dN)及其比值(dS/dN);采用MEGA 4软件的邻接法(Neighbor-joining)中的最大可能性算法(Maximum likelihood method)构建系统进化树。结果 CSBV重庆分离株片段SB1-2、SB6-7和SB14-15的序列同源性高于99.06%,序列保守,3个片段序列均只发现少数点变异碱基,属于亚洲型,与东方蜜蜂广州分离株和韩国分离株的亲缘关系最近;CSBV重庆分离株存在特有的核苷酸和氨基酸位点,且与亚洲型分离株存在广泛的共有基序;亚洲型分离株的替换率高于欧洲型分离株。结论 CSBV分离株存在型特异的遗传变异规律。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。     

中蜂囊状幼虫病病毒重庆株编码序列分析

目的分析中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)重庆株(CSBV-CQ)编码序列的分子特性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV编码序列片段,并进行序列测定,使用ClustalW2软件进行多序列比对分析,利用推导的氨基酸序列进行保守结构域BLAST和同源建模,采用MEGA 4软件的邻接法(neighbor-joining)中的最大可能性算法(maximum likelihood method)构建系统进化树。结果扩增的片段拼接出8 358 nt的片段,约占SBV基因组长度的95%;CSBV-CQ与CSBV-GZ的核苷酸和氨基酸序列同源性均最高,在CSBV-GZ的2 270² 320位碱基缺失51 nt核苷酸;多聚蛋白N-末端包含2个小RNA病毒衣壳蛋白药物结合口袋(drug-binding pocket)结构域(domain),C-末端包含RNA解旋酶(RNA helicase)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)2个结构域;基于基因组水平的系统进化分析显示,所有东方蜜蜂分离株、西方蜜蜂分离株AmSBV-Kor19构成1个基因型,但基于基因组片段的分子系统进化分析显示,部分毒株包含2个基因型片段。结论 SBV基因型间存在基因重组现象。     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

目的建立猪细小病毒(PPV)PCR检测方法。方法设计一对针对PPV的特异引物,经方阵滴定法确定PCR检测的最佳条件,以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行斑点杂交鉴定。提取已知滴度的病毒培养物DNA为模板,稀释后进行PCR扩增,测定PCR方法的敏感性。采用此方法检测了180份猪各种组织样品的DNA及PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型。结果仅PPV野毒株和北京分离株AV7909能够扩增出一条531bp的片段,测序结果证明为PPV的特异片段。该方法所能检测的最小病毒滴度值为0.398TCID50,可以检测出PPV-猪组织混合感染PK-15细胞模型中0.500 TCID50的感染量。180份组织样品均未检出PPV。结论该方法具有良好的特异性和敏感性。     

中蜂囊状幼虫病毒VP1基因的优化表达及其免疫原性分析

目的原核表达优化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的VP1基因,并分析其免疫原性。方法根据大肠埃希菌密码子偏爱性对野生型CSBV VP1(wt VP1)基因进行优化(opti VP1),将基因wt VP1和opti VP1分别克隆至p GEX-6P-1原核表达系统,构建原核表达质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1,分别转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并对诱导温度、IPTG终浓度及诱导时间进行优化,诱导蛋白经Western blot鉴定;重组蛋白经GSH-琼脂糖凝胶层析纯化;分别用PBS、纯化的GST标签蛋白、纯化的重组蛋白及CSBV纯化病毒免疫小鼠,经间接ELISA法检验各组小鼠的血清抗体效价。结果优化后的VP1基因序列降低了密码子影响指数,提高了密码子适应指数;质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1经鉴定证明构建正确;最佳诱导表达条件为:IPTG终浓度0.8 mmol/L,30℃,220 r/min诱导8 h;诱导表达蛋白占菌体总蛋白百分比由wt VP1菌株(5.49±0.30)%提高至opti VP1菌株(59.7±0.51)%,纯化后纯度可达0.5 mg/ml;兔抗GST标签抗体及兔抗CSBV血清均与优化后的重组蛋白发生特异性反应;重组蛋白组小鼠二免后可产生较高水平抗体,明显高于PBS组和GST标签蛋白组(P0.05)。结论通过密码子优化实现了CSBV结构基因VP1的高效表达,表达蛋白可诱导小鼠机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性,为探讨CSBV感染的分子发病机制和制备抗CSBV病毒的多克隆抗体奠定了基础。     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立鸭瘟病毒PCR检测方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的鸭瘟病毒基因(UL30、UL31)序列,设计合成1对特异性引物,以鸡胚化弱毒疫苗株病毒基因组DNA为模板,进行PCR扩增。优化PCR的反应条件,并对方法的敏感性、特异性及适用性进行验证。结果经PCR可扩增得到446 bp的目的基因条带,测序结果与已发表的序列同源性达100%。该方法的最低检出限为2.1 pg,对7种鸭易感性病原体及3种鸭瘟病毒同类病原体的检测结果均为阴性。结论已建立了敏感、特异、快速的鸭瘟病毒PCR检测方法。     

国内不同基因型Asia1型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立口蹄疫病毒(FMDV)Asia1型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法。方法在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asia1型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件,并进行特异性及相关病毒检测。结果优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好,检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致。结论已建立了FMDVAsia1型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础。     

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。     

新疆伊犁地区牧羊犬脑内亨德拉病毒感染情况

目的分析新疆伊犁地区草原放养牧羊犬脑内亨德拉病毒(Hendravirus,HeV)的感染情况。方法采用一步法实时荧光定量RT-PCR检测HeV核蛋白(N)基因片段,并验证该方法的敏感性和特异性。采用该方法对采自新疆伊犁地区草原放养、未接种HeV疫苗的101例牧羊犬脑组织进行HeV N基因片段检测。结果建立的一步法实时荧光定量RT-PCR检测HeV N基因的最低检出浓度为2.6×102 copies/μl;与其他单股负链RNA病毒,如同属且高度同源的尼帕病毒(Nipah virus,NiV)和博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)等无交叉反应;101份牧羊犬脑组织样本HeV N基因的检测结果均为阴性。结论尚未发现我国新疆伊犁地区天然牧场放养牧羊犬中存在HeV感染的证据,该地区短时间内爆发HeV感染的危险性不大。     

新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一步法RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据NDV F基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立一步法RT-PCR检测方法,并验证其特异性及敏感性;应用建立的方法对23份疑似新城疫(Newcastle disease,ND)病料进行检测,并与血凝及血凝抑制试验检测结果进行比对。结果建立的一步法RT-PCR同时检测NDV、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)和禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H9亚型,仅NDV为阳性,IBDV和AIV H9均为阴性;该方法最低可检出约4 pg的NDV RNA;23份疑似ND病料,一步法RT-PCR检出11份阳性,血凝及血凝抑制试验检出13份阳性,两种方法的阳性符合率为85%。结论建立了NDV一步法RT-PCR检测方法,该方法特异性良好,敏感度较高,用时较短,可从分子水平上对NDV进行早期快速诊断和流行病学调查。     

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。